不同酵母對大米生料釀酒的釀造特性研究

李媛媛，李星，張立偉，蔡永陽，黃治國，2，*，任志強，2，*

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000）

生料釀酒技術最早由日本人在20世紀50年代提出，20世紀70年代世界各國競相研究，我國的生料釀酒技術曾在20世紀80年代掀起過高潮[1]。生料釀酒與傳統(tǒng)釀酒相比，免去了浸泡、初蒸、燜糧等八道工序，節(jié)約燃料35%～60%，出酒率高，減少人工50%以上，降低生產(chǎn)成本30%以上，具有較高的社會和經(jīng)濟效益，是現(xiàn)代釀酒行業(yè)的發(fā)展方向之一[2－4]。

不同的糧食釀出來的酒具有不同的特點；相同的糧食加入不同的微生物進行發(fā)酵，酒質(zhì)也會有較大的差別，其原因可能為不同微生物的代謝通路存在一定的差別[5－6]。不同的釀酒原料的最適釀造微生物可能不同[7]。因此，篩選針對某一特定原料進行釀酒的微生物具有研究意義。

目前有很多關于相同曲藥、不同原料的生料釀酒釀造特性研究[8－10]；而很少有關于同一種原料，不同發(fā)酵微生物釀酒釀造特性研究。為了獲得針對以大米為原料，發(fā)酵性能優(yōu)良、性狀穩(wěn)定的生料釀造菌株，本研究通過構建大米生料釀酒實驗室研究平臺，對18株酵母進行了以大米為原料的生料釀酒發(fā)酵研究，篩選出一株較適合用于大米生料釀酒的微生物。該酵母可作為大米釀酒生料曲的備選菌株；該方法對生料釀酒的菌種篩選具有指導意義。針對不同的原料采用不同的微生物制備的生料曲進行釀造，以提高生料釀酒的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌：由四川理工學院釀酒重點實驗室菌種保藏中心提供；大米：市售秈米；糖化酶：江蘇博立生物制品有限公司；淀粉酶：上?？颠_食品工程有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

250HL恒溫恒濕培養(yǎng)箱：金壇市醫(yī)療儀器廠；VG－3渦旋振蕩器：德國進口；SHP生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母的活化與擴大培養(yǎng)

取釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室保存的酵母菌斜面，取酵母菌接種于含10 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的試管中，28℃，120 r/min，24 h振蕩培養(yǎng)對酵母菌進行復蘇。將復蘇后的培養(yǎng)液采用劃線分離的方式劃線于PDA固體培養(yǎng)中，28℃恒溫培養(yǎng)24 h。

從活化后的培養(yǎng)基中挑取生長良好的酵母菌，接種于10 mL PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min培養(yǎng)12 h。1%的轉種量接種于150 mL PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min培養(yǎng)12 h獲得種子液。6 000 r/min離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌3次后獲得鮮酵母。

1.3.2 酒的發(fā)酵與蒸餾

大米100 g，自來水250 mL、糖化酶1 g、淀粉酶1 g，鮮酵母1 g（濕重），置于500 mL三角瓶中，攪拌均勻，保鮮膜封口，25℃發(fā)酵20 d。

將發(fā)酵好的發(fā)酵醪液全部轉移至圓底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，加入沸石，連接好蒸餾裝置進行蒸餾取酒；每個樣品蒸餾200 mL酒樣。

1.3.3 失重的測定

失重即經(jīng)酵母發(fā)酵前后發(fā)酵液質(zhì)量的變化。失重/g=原重－剩重

1.3.4 出酒率的測定

將1.3.2中蒸餾得到的酒樣用酒精計測得每組酒樣的酒精度，每組酒樣測3次，取平均值。

出酒率/%=酒精度×蒸餾后酒樣的量×乙醇的密度÷大米投加量

1.3.5 總酯的測定

吸取50 mL酒樣于圓底燒瓶中，加2滴酚酞指示劑，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至粉紅色，記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積。再準確加入氫氧化鈉標準滴定溶液20 mL，加入3粒沸石并裝好冷凝回流裝置，于沸水浴上回流30 min，取下，冷卻。然后，用硫酸標準滴定溶液進行滴定，以微紅色剛好完全消失為其終點，記錄消耗硫酸標準滴定溶液的體積。同時吸取50 mL酒樣，做空白試驗作對照，記錄消耗硫酸標準滴定溶液的體積。

計算公式：

式中：X為酒樣中總酯的含量，g/L；c為硫酸標準滴定溶液的實際濃度，mol/L；V0為空白試驗樣品消耗0.1 mol/L H2SO4溶液的體積，mL；V1為樣品消耗0.1 mol/L H2SO4溶液的體積，mL。

1.3.6 總酸的測定

吸取50 mL酒樣于錐形瓶中，加酚酞2滴，以氫氧化鈉標準溶液滴定樣品至微紅色，即為其終點，并記錄數(shù)據(jù)。計算公式：

式中：X為酒樣中總酸的含量，g/L；C為氫氧化鈉標準滴定溶液的實際濃度，mol/L；V為消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL。

1.3.7 氣相色譜質(zhì)譜條件

1.3.7.1 氣相色譜（gas chromatography，GC）條件

毛細管柱；程序升溫：初始溫度40℃保持1 min，然后以5℃/min升溫至180℃，保持1 min，再8℃/min升溫到230℃，保持7 min；進樣口溫度240℃；載氣：高純度氦氣（He），流速為1 mL/min；不分流進樣。

1.3.7.2 質(zhì)譜（mass spectrometer，MS）條件

電子電離源（electronionization，EI），電子能力70eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，接口溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍20 u～50 u，溶劑延遲3 min。

1.3.8 定性與成分分析

定性分析：檢測出揮發(fā)性組分的質(zhì)譜圖，通過與標準譜庫（NIST05a.L）對比鑒定，匹配度大于75%的予以確認。

成分分析：通過GC－MS分析檢測得出白酒的風味物質(zhì)的總離子流圖，采用數(shù)據(jù)分析軟件進行譜庫（NIST8.0）檢索及相關文獻分析，對相應的風味物質(zhì)成分進行鑒定。

2 結果與討論

市售生料釀酒曲至少包含有兩種微生物，根霉和酵母。其中，根霉主要提供糖化所需的酶類，將釀酒原料轉化成可發(fā)酵性糖，酵母的主要作用是將可發(fā)酵性糖轉變成乙醇[11]。試驗要探索不同酵母對大米生料釀酒的釀造特性，就要固定其他條件，只改變酵母的種類。為了最大限度的減少其他微生物對酵母的影響，本研究采用“糖化酶+酵母”的模式構建生料釀酒實驗室研究平臺。以相同的原料投加量，相同酶的投加量，相同的發(fā)酵溫度進行試驗，從失重、出酒率、總酯、總酸和風味物質(zhì)等方面考查不同酵母對大米生料釀酒的釀造特性。

2.1 不同酵母生料發(fā)酵前后的失重

酵母將淀粉轉化為CO2、酒精和其他副產(chǎn)物等；在發(fā)酵期間失去的重量就是CO2的質(zhì)量，CO2的產(chǎn)量越多，說明其發(fā)酵起步早、速度快，能較早的達到主發(fā)酵期，形成生長優(yōu)勢，較好的抑制雜菌，使發(fā)酵過程中的生理生化反應正常進行，對酒的質(zhì)量有初步的保證，酵母的發(fā)酵性能較為良好；本研究的18種酵母發(fā)酵前后失重數(shù)據(jù)見圖1。

圖1 不同酵母發(fā)酵前后的失重Fig.1 Weightlessness before and after fermentation of different yeast

如圖1，失重最高的是酵母1，達到了41.85 g；其中酵母18、酵母6、酵母10、酵母11、酵母15這5株酵母菌種的失重都超過了41 g，失重最低的是酵母12，只有25.52 g，在相同條件下，只是加入的酵母不同其失重也存在一定的差異，說明酵母的不同的確會影響發(fā)酵后發(fā)酵液里的物質(zhì)成分。

2.2 不同酵母生料發(fā)酵的出酒率

酵母在分解大米中的淀粉時，酒精和CO2是同一反應的產(chǎn)物，即CO2產(chǎn)生的量越多，酒精產(chǎn)生越多；也就是說失重多，出酒率就高；失重直觀的反映了菌種在釀酒過程中對原料的使用情況，出酒率反映菌株對原料的轉化率；通過對這兩者的測定就能更好的反映不同酵母的發(fā)酵性能；酵母出酒率數(shù)據(jù)見圖2。

淀粉轉化為酒精的理論值為56.76%，而大米的淀粉含量為75%，如果按淀粉轉化為酒精是100%，大米的理論出酒率也只能達到42.57%[12]；但由于使用糖化酶，減少了霉菌對大米中淀粉的消耗，添加鮮酵母，酵母繁殖的淀粉消耗要少一些，如圖2可以看出這樣做其出酒率可以高達43.13%，但也有較低的出酒率為24.49%，其他都介于兩者之間，說明不同酵母大米生料發(fā)酵對出酒率的影響是不相同的。

圖2 不同酵母發(fā)酵后的出酒率Fig.2 The yield of wine after fermentation by different yeast

2.3 不同酵母生料釀酒對白酒總酯的影響

總酯是白酒中多種酯的總稱，它是白酒中重要的呈香呈味物質(zhì)，總酯分析是白酒中重要的檢測項目，是判定白酒合格與否的重要指標之一[13]。乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯是白酒中的三大主要酯類，其含量占總酯的90%上，總酯越高，白酒越香，所以說要比較酵母的發(fā)酵性能，比較其產(chǎn)出酒的總酯含量是必須的。

對發(fā)酵蒸餾后的酒樣進行總酯的測定（具體方法見1.3.4）結果見圖3。

圖3 不同酵母對總酯的影響Fig.3 The effect of different yeast on the total ester

總酯含量最高的是酵母2，達到了0.69 g/L，最低的是酵母9，為0.45 g/L。其他的介于兩者之間。總體而言：酵母2、酵母15、酵母3的產(chǎn)酯能力較強，由圖3可知不同酵母以大米為原料進行生料釀酒時產(chǎn)酯能力是存在差別的，其可能的原因有酵母本身產(chǎn)酯的能力存在差別，也有可能是對原料的利用上存在差別，比如同一種菌對不同的原料進行發(fā)酵，其產(chǎn)酯能力也會存在差別[14]。

2.4 不同酵母生料釀酒對總酸的影響

白酒中的酸是主要呈味物質(zhì)之一，對白酒而言，它的酸類物質(zhì)主要由有機酸組成；酸與白酒中的酯、醇、醛等物質(zhì)相比，其作用力最強，功能相當豐富，影響面廣，比如可以消除酒的苦味、是新酒老熟的有效催化劑、是白酒最重要的味感劑，同時還對白酒香氣有抑制和掩蓋作用，因此測定酒中的總酸含量也是必須的[15]。

對發(fā)酵蒸餾后的酒樣進行總酸的測定，結果如圖4。

總酸含量最高的是酵母13，達到了1 g/L，最低的是釀酒酵母5，為0.06 g/L。其他的介于兩者之間?？傮w而言：酵母13、酵母3、酵母12的產(chǎn)酸能力強，說明不同酵母大米生料發(fā)酵對產(chǎn)酸的影響是不相同的。

2.5 不同酵母生料發(fā)酵對白酒風味物質(zhì)的影響

風味物質(zhì)在白酒中只占3%左右，屬于白酒中的微量物質(zhì)，而這些微量成分可通過嗅覺、視覺、觸覺和味覺引起感官的刺激，其種類、含量和量比關系決定著白酒香型和風味質(zhì)量，所以對酵母發(fā)酵后酒中的風味物質(zhì)的測定有一定的必要性。生料釀酒中主要的風味物質(zhì)有奇數(shù)碳脂肪酸乙酯、正丙醇、高級脂肪酸乙酯和乳酸乙酯，而在本研究中不同酵母生成的酒主要測出有丙醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯3個成分，且不同酵母生成3種物質(zhì)的量也各有不同，說明不同酵母對風味物質(zhì)有一定的影響。

不同酵母生料發(fā)酵中白酒風味物質(zhì)成分GC-MS分析。18種不同酵母發(fā)酵后酒樣的風味物質(zhì)對比結果見圖5。

圖5 不同酵母發(fā)酵后對風味物質(zhì)含量影響Fig.5 Effect of different yeast fermentation on flavor compounds content

從圖5中可以看出，不同酵母產(chǎn)酒的風味成分可能會有所不同，風味成分含量也有很大的區(qū)別，綜合來看酵母15、酵母3以及酵母10的3種風味物質(zhì)含量很高，所以從風味物質(zhì)的成分與含量來看這3種酵母的發(fā)酵性能較為良好。

3 結論

本研究通過不同酵母對大米的生料釀酒后，發(fā)酵液的失重、出酒率、總酯、總酸和風味物質(zhì)的測定和對比篩選出以大米為原料生料釀酒的發(fā)酵性能較好的生產(chǎn)菌。結果表明：酵母1、酵母18、酵母6、酵母10、酵母11、酵母15這6株酵母菌種的失重都超過了41 g，失重越多說明該酵母能夠?qū)⒌矸坜D化為酒精和二氧化碳的能力越強，因此發(fā)酵后的還原糖和總糖的殘余量就越低；酵母1、酵母6、菌株酵母10、酵母15、酵母18出酒率較高，出酒率都超過了40%；通過GC-MS測定氣相成分得知：酵母15產(chǎn)酯能力較強，產(chǎn)酯含量超過了0.50 g/L。從以上數(shù)據(jù)可以看出酵母15無論從失重、出酒率和酒中風味物質(zhì)都要比其他菌株好，所以酵母15在以大米為原料的生料釀酒中具有一定的優(yōu)勢，適合作為生產(chǎn)菌。