啤酒中氰化物的快速檢測(cè)

伏笑麗，洪霞，袁彩霞，錢瀅文，何海寧，張彥軍，柴宗龍，王杰斌

（甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州730010）

隨著人們生活水平和質(zhì)量的不斷提高，我國(guó)的啤酒工業(yè)也隨著發(fā)展起來(lái)了，啤酒產(chǎn)量有了較大幅度的增長(zhǎng)，已成為世界五大啤酒生產(chǎn)國(guó)之一[1-3]，2002年至今，全國(guó)啤酒年產(chǎn)量超過(guò)2 500萬(wàn)噸，居世界首位[4]。啤酒生產(chǎn)過(guò)程中的污染物主要來(lái)自空氣、自來(lái)水、原料和輔料、接種酵母、設(shè)備和管路、包裝材料以及各種用具和操作人員等[5-6]。因此，水中的氰化物已經(jīng)成為影響啤酒質(zhì)量的重要因素之一[7]，氰化物不但會(huì)污染環(huán)境，還會(huì)使人、畜中毒甚至死亡，即使像鐵氰酸鹽和亞鐵氰酸鹽那樣的低毒性氰化物復(fù)鹽，如果大量排入地面水中，經(jīng)過(guò)陽(yáng)光照射和其他條件的配合也可以分解釋放出相當(dāng)數(shù)量的游離氰化物，導(dǎo)致水生物的中毒死亡[8-10]。而且氰化物是一類有氰基（CN-）的劇毒化合物，主要指氰酸鹽和氫氰酸，可通過(guò)呼吸道、消化道及皮膚進(jìn)入人體內(nèi)。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，啤酒中的污染物主要包括微生物、廢氣物、磷類化合物、氨氮等[11]。管海齊[12]利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法研究大麥、麥芽、啤酒樣品中赭曲霉毒素，該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、抗干擾?。桓邼嵉萚13]選用基于杯[6]芳烴溶膠-凝膠固相微萃取（solid-phase micro extraction，SPME）萃取頭，建立頂空SPME與氣相色譜聯(lián)用檢測(cè)啤酒中8種酞酸酯的方法，利用該方法對(duì)國(guó)內(nèi)和國(guó)外啤酒進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)盡管不同酒種的老化物質(zhì)含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)存在著不同程度的差異，但總體上老化物質(zhì)的含量會(huì)隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；李建平等[14]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定啤酒中的4-甲基咪唑的含量，本方法靈敏、快速、準(zhǔn)確，可用于啤酒中4-甲基咪唑的測(cè)定；張輝珍等[15]利用離子色譜儀測(cè)定啤酒中6種無(wú)機(jī)陰離子的含量，該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度和精密度高，適用于啤酒中無(wú)機(jī)離子的測(cè)定；杜軍良等[16]建立分散液液微萃取-火焰原子吸收光度法測(cè)定啤酒中痕量銅的方法，探討了分散劑用量、萃取劑用量、pH值、震蕩時(shí)間、絡(luò)合劑用量等因素對(duì)萃取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用該法測(cè)定啤酒中的銅含量令人滿意。但是目前為止，有關(guān)啤酒中氰化物含量檢測(cè)報(bào)道文獻(xiàn)很少。

食品安全是國(guó)家和公眾普遍關(guān)注的關(guān)鍵問(wèn)題，而氰化物是啤酒產(chǎn)品的一項(xiàng)重要安全檢測(cè)指標(biāo)[17-19]，我國(guó)作為酒類產(chǎn)品消費(fèi)大國(guó)，建立一種快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)啤酒中氰化物含量的方法具有重要意義。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，食品中氰化物的檢測(cè)方法主要有分光光度法[20]、氣相色譜法[21]，離子色譜法[22]、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀法[23]、液相色譜法等[24]。本試驗(yàn)嘗試采用頂空氣相色譜法測(cè)定啤酒樣品中氰化物的含量，將氰化物利用氯胺T衍生劑在磷酸提供的介質(zhì)中衍生為氯化氰后，直接進(jìn)頂空氣相色譜法（electron capture detector，ECD）檢測(cè)器檢測(cè)，樣品不需要蒸餾處理，且省去了傳統(tǒng)方法的蒸餾與手工測(cè)定比重等繁瑣操作，數(shù)據(jù)可靠，干擾小，檢測(cè)的靈敏度高，分析速度快，干擾小，實(shí)用性強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 儀器

XS 225A-SCS電子天平：普利賽斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；GENIUS3渦旋振蕩儀：上海右一儀器有限公司；移液管：蘭州百源基因有限公司；吸耳球：蘭州百源基因有限公司；CF16RXⅡ臺(tái)式高速離心機(jī)：上海東兢電子有限公司；SB-100B超聲波清洗機(jī)：甘肅宇豐有限公司；Agilent 7890B頂空氣相色譜儀：德國(guó)安捷倫/Agilent Technology。

1.2 試劑

水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.8%）：北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院；磷酸（99.8%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯胺T（99.3%）：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；丙酮（色譜純，99.6%）、正己烷（色譜純，99.6%）：西安市永紅化工原料公司；啤酒樣品：蘭州市城關(guān)區(qū)同期生產(chǎn)的啤酒；二次蒸餾水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

氰離子標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的配制：將購(gòu)買的水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成10 mg/L儲(chǔ)備液并于冰箱保存，使用時(shí)將其儲(chǔ)備液用水稀釋成質(zhì)量濃度為0、0.001、0.002、0.010、0.050、0.100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。準(zhǔn)確移取10 mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于頂空瓶中，加入0.2 mL（體積分?jǐn)?shù)20%）磷酸溶液，渦流混合，然后加入0.3 mL濃度為10 g/L的氯胺T溶液，立即加蓋密封，渦流混合，取其配制好的溶液于頂空氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，不同濃度的樣本均重復(fù)進(jìn)樣3次，取測(cè)定出的峰面積的均值，依據(jù)氰化物含量和其對(duì)應(yīng)的峰面積均值即可繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確移取10.0 mL 15種不同品牌的啤酒試樣于頂空瓶中，加入0.2 mL（體積分?jǐn)?shù)20%）磷酸溶液，渦流混合，然后加入0.3 mL 10 g/L的氯胺T溶液，立即加蓋密封，渦流混合，待測(cè)。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：DB-FFAP（30 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：200℃；檢測(cè)器溫度：300℃；升溫程序：40℃（5 min）→50℃/min→200℃（2 min）；氮?dú)庾鳛檩d氣，流速2.0 mL/min，純度不低于99.999%；分流比：80∶1。

1.3.4 頂空條件

平衡時(shí)間：50 min；加熱箱溫度：55℃；定量環(huán)溫度：65℃；傳輸線溫度：100℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的條件選擇

采用的檢測(cè)技術(shù)是頂空氣相色譜法，溶液的渾濁和顏色都不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，所以啤酒樣品不需要蒸餾直接取樣進(jìn)行測(cè)定。

2.2 衍生劑用量的選擇

由于氰離子不能直接被氣相色譜檢測(cè)，因此，需要經(jīng)過(guò)加入衍生劑處理將其轉(zhuǎn)化為具有揮發(fā)性和穩(wěn)定性的衍生物，從而實(shí)現(xiàn)氣相色譜分析。具體試驗(yàn)過(guò)程如下：利用氯胺T作為衍生劑衍生法反應(yīng)生成氯化氰衍生物，氯化氰具有沸點(diǎn)低、易揮發(fā)的特點(diǎn)，可以滿足頂空氣相色譜進(jìn)樣檢測(cè)。采用頂空氣相色譜技術(shù)不僅大大降低了對(duì)樣品的前處理操作過(guò)程，并且減少了樣品本身可能對(duì)分析的干擾或污染，同時(shí)頂空分析技術(shù)對(duì)分析人員和環(huán)境危害小、方法重現(xiàn)性好、能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

衍生劑氯胺T的用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，準(zhǔn)確移取7份啤酒試樣10 mL于頂空瓶中編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7，分別加入 20 μL 濃度為 0.01 mg/L 氰離子標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再依次添加 50、100、200、300、350、400、500 μL濃度為10 g/L的氯胺T衍生劑溶液，氯胺T的用量對(duì)色譜響應(yīng)值的影響見圖1。

圖1 衍生劑用量的選擇Fig.1 The option of derivatives dosage

由圖1可以看出當(dāng)氯胺T用量達(dá)到300 μL后峰面積達(dá)到最大，即可獲得滿意的結(jié)果。

2.3 頂空平衡溫度選擇

平衡溫度對(duì)樣品氣化過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，頂空氣相色譜選擇平衡溫度為 20、30、40、50、55、60 ℃共6個(gè)溫度進(jìn)行試驗(yàn)見圖2。

圖2 頂空平衡溫度Fig.2 Headspace equilibrium temperature

由圖2可知，響應(yīng)值隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到50℃后變化不大，由于溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致進(jìn)樣的雜質(zhì)增大，因此，最終選擇55℃為頂空氣相色譜平衡溫度。

2.4 頂空平衡時(shí)間的選擇

平衡時(shí)間是影響衍生效果的主要因素之一，對(duì)啤酒樣品中加入30 μL濃度為0.01 mg/L的氰化物標(biāo)準(zhǔn)溶液后，平衡時(shí)間選擇 20、30、35、40、50、55、60、65 min分別進(jìn)行考察，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出當(dāng)頂空平衡時(shí)間為50 min后即達(dá)到穩(wěn)定，故頂空氣相色譜最終平衡時(shí)間選擇為50 min。

圖3 頂空平衡時(shí)間Fig.3 Headspace equilibrium time

2.5 衍生pH值的選擇

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)顯示，溶液的酸堿性對(duì)該衍生有很的大影響，因此可以在頂空瓶中通過(guò)加入濃磷酸達(dá)到調(diào)節(jié)pH值的目的，結(jié)果見圖4。

圖4 衍生pH值的選擇Fig.4 The option of pH

由圖4可知，通過(guò)觀察對(duì)色譜響應(yīng)值的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，峰面積值隨著pH值得增大而增大，當(dāng)溶液pH值在5.5～6.5范圍內(nèi)時(shí)峰面積沒有明顯差別，所以本方法選用pH值在5.5～6.5作為本試驗(yàn)衍生條件。

2.6 實(shí)際樣品的分析

對(duì)15種不同品牌啤酒樣品中的氰化物含量進(jìn)行測(cè)定分析。分別吸取10 mL15種不同品牌啤酒于頂空進(jìn)樣瓶中，加入0.2 mL磷酸（體積分?jǐn)?shù)20%），渦旋1 min后再加入0.3 mL現(xiàn)配的氯胺T溶液，進(jìn)頂空氣相色譜儀分析，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 15種不同品牌啤酒中氰化物含量的測(cè)定Table 1 Determination of cyanide content in 15 different brands of beer

續(xù)表1 15種不同品牌啤酒中氰化物含量的測(cè)定Continue table 1 Determination of cyanide content in 15 different brands of beer

2.7 線性范圍的考察

通過(guò)添加回收試驗(yàn)確定其線性范圍，分別配制氰離子濃度為 0、0.001、0.002、0.005、0.01、0.05、0.1 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜測(cè)定，以峰面積（Y軸）對(duì)氰化物的衍生物的濃度（X軸）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出氰化物在0.001 mg/L～0.1 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性方程為：y=19 374.727 3x+17.601 561，相關(guān)性系數(shù)為0.999 14，檢出限0.000 56 mg/L。在上述條件下，氰離子衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖5。

圖5 氰離子衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curve of cyanide ion derivatives

2.8 方法的回收率和精密度試驗(yàn)

選用7號(hào)啤酒作為基質(zhì)，分別加入濃度為0.01mg/L氰離子標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液30 μL和50 μL進(jìn)行2個(gè)濃度水平添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度水平做3個(gè)平行樣品。方法的回收率和精密度[用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示]數(shù)據(jù)見表2。

表2 回收率和精密度Table 2 Recovery and precision

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用直接取啤酒樣品加入衍生劑后，采用頂空氣相色譜法檢測(cè)啤酒中氰化物含量。該方法操作簡(jiǎn)便、快捷，大大縮短了檢測(cè)周期，同時(shí)對(duì)環(huán)境沒有什么破壞，是一種環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、快速的檢測(cè)方法，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度和精密度較高，抗干擾小。為啤酒制品的質(zhì)量保證提供了強(qiáng)有力的支持，尤其是面對(duì)大批量樣品的檢測(cè)，更能體現(xiàn)出方法的優(yōu)越性。