新型防腐劑對(duì)面制品中微生物抑菌效果的研究

張小華，操慶國(guó)，郭欽

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212400；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

面制品是一種有著悠久歷史的傳統(tǒng)食品，制作的工藝多，產(chǎn)品種類也較多。在面制品制作為成品的同時(shí)，腐敗變質(zhì)問(wèn)題一直困擾左右，而腐敗變質(zhì)問(wèn)題主要由微生物引起的[1]。直至防腐劑的出現(xiàn)，一定程度上解決了面制品腐敗的問(wèn)題，延長(zhǎng)了貯藏時(shí)間。一般添加到食品的防腐劑種類很多，偶爾食用問(wèn)題不大，但是長(zhǎng)期食用也會(huì)在體內(nèi)富集從而影響人體健康[2]，特別是人們?nèi)粘Ｉ钪惺秤昧枯^大的面制品，因此國(guó)標(biāo)GB2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》也對(duì)面制品中防腐劑使用量有明確限制[3]。

隨著現(xiàn)代人們生活水平的提高，對(duì)食品安全的標(biāo)準(zhǔn)和要求也在提高，發(fā)現(xiàn)并使用更安全更高效的防腐劑一直在不斷的研究中。新型的食用防腐劑一般分為化學(xué)制劑的和生物制劑兩大類，化學(xué)類的有丙酸鈣、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、乳酸鈉和富馬酸等[4－8]，生物類的有聚賴氨酸、納他霉素和乳酸鏈球菌素等[9－13]。本試驗(yàn)從腐敗的面制品中分離出5種共11株霉菌[14－16]（包括2株青霉菌、2株黃曲霉菌、3株絲孢酵母菌、1株黑根霉菌、3株黑曲霉菌），針對(duì)這些不同菌種以及同種不同株之間的差異，研究以上幾種新型防腐劑對(duì)其抑菌效果，旨在為面制品新型防腐技術(shù)的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

富馬酸、乳酸鈉、丙酸鈣、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、納他霉素、聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素：中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。2株青霉菌、2株黃曲霉菌、3株絲孢酵母菌、1株黑根霉菌、3株黑曲霉菌：分離自不同來(lái)源腐敗變質(zhì)的面制品?？販?fù)u床培養(yǎng)箱（AG3000）：無(wú)錫市AIBOER科技技有限公司；臺(tái)式培養(yǎng)箱（RT151）：杭州長(zhǎng)城儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基的配制：按照培養(yǎng)基所要求的比例，加熱沸騰至完全溶解，分裝后高壓滅菌備用。

察氏液體培養(yǎng)基的配制：參照GB4789.28－84《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》進(jìn)行配制[17]。

1.2.2 菌懸液的制備

將5種共11株霉菌32℃條件下分別在PDA斜面培養(yǎng)基上活化24 h，之后霉菌菌種再分別接種于察氏液體培養(yǎng)基中，在28℃下震蕩培養(yǎng)36 h，菌液的濃度約為107CFU/mL。

1.2.3 抑菌活性的測(cè)定

以培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基為基質(zhì)，分別添加含不同濃度防腐劑作為試驗(yàn)對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組用無(wú)菌水取代防腐劑[18－22]?；旌隙ㄈ莺髮⑴囵B(yǎng)液各取0.1 mL涂平板，32℃條件下培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)并以此計(jì)算各種防腐劑的抑菌率。

1.2.4 最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定

根據(jù)不同濃度防腐劑對(duì)霉菌的抑菌效果，初步確定MIC的范圍。再在此范圍內(nèi)配制不同濃度的防腐劑溶液測(cè)定其抑菌率，抑菌率為100%的濃度即為最低抑菌濃度[23－24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度防腐劑對(duì)5種霉菌抑菌效果的比較

分別配制0.1、1.0、10 mg/mL等3個(gè)梯度濃度的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中，混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率，考察對(duì)青霉菌、黃曲霉菌、絲孢酵母菌、黑根霉菌和黑曲霉菌的抑菌效果，同種不同株之間的抑菌效果以平均抑菌效果計(jì)，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)各種菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against different species of mould

圖2 濃度為1 mg/mL的防腐劑對(duì)各種菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 1 mg/mL against different species of mould

圖3 濃度為10 mg/mL的防腐劑對(duì)各種菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 10 mg/mL against different species of mould

由圖1～圖3可知，納他霉素和聚賴氨酸對(duì)青霉菌、黃曲霉菌、絲孢酵母菌和黑根霉菌抑菌效果較好，0.1 mg/mL的納他霉素和聚賴氨酸基本能達(dá)到對(duì)4種霉菌100%的抑菌效果，但是對(duì)黑曲霉菌的抑菌效果不明顯，10 mg/mL的納他霉素才能達(dá)到75%的抑菌效果，以及10 mg/mL的聚賴氨酸才能達(dá)到98%的抑菌效果；而1 mg/mL的乳酸鏈球菌素對(duì)5種霉菌能達(dá)到100%的抑菌率；富馬酸的整體的抑菌效果最不理想，0.1 mg/mL濃度對(duì)絲孢酵母菌、黑根霉菌和黑曲霉菌的抑菌率為0，10 mg/mL濃度也只能對(duì)絲孢酵母菌達(dá)到100%的抑菌率。

2.2 同種不同株之間抑菌效果的比較

2.2.1 青霉菌株之間抑菌效果的比較

分別配制濃度為0.1 mg/mL的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中，混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率，考察對(duì)青霉菌不同菌株之間的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，0.1 mg/mL濃度的納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸溶液對(duì)青霉菌株的抑菌效果較好，基本能達(dá)到100%，且對(duì)青霉菌1和青霉菌2的抑菌效果差異不大；乳酸鈉對(duì)青霉菌1和青霉菌2的抑菌效果有差異，兩者之間相差達(dá)到30%；富馬酸對(duì)青霉菌的抑菌效果最差，抑菌效果只能達(dá)到20%。

2.2.2 黃曲霉菌株之間抑菌效果的比較

分別配制濃度為0.1 mg/mL的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中，混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率，考察對(duì)黃曲霉菌不同菌株之間的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，0.1 mg/mL濃度的納他霉素、乳酸鏈球菌素、聚賴氨酸溶液對(duì)2種黃曲霉菌株的抑菌效果都很好，抑菌率能達(dá)到100%；對(duì)羥基苯甲酸丙酯對(duì)黃曲霉菌1和黃曲霉菌2的抑菌效果有明顯差異，兩者之間相差達(dá)到90%；富馬酸和乳酸鈉對(duì)黃曲霉菌株的抑菌效果最差，且菌株之間的抑菌效果差不多。

圖4 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)不同株青霉菌的抑菌效果Fig.4 Bacteriostatic effect of 0.1 mg/mL preservative on different strains of Penicillium

圖5 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)不同株黃曲霉菌的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effect of preservatives of 0.1 mg/mL on different strains of Aspergillus flavus

2.2.3 絲孢酵母菌株之間抑菌效果的比較

分別配制濃度為0.1 mg/mL的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中，混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率，考察對(duì)絲孢酵母菌3種不同菌株之間的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)不同株絲孢酵母菌的抑菌效果Fig.6 Bacteriostatic effect of preservatives of 0.1 mg/mL on different strains of trichosporon

由圖6可知，0.1 mg/mL濃度的納他霉素和聚賴氨酸對(duì)3種絲孢酵母菌株的抑菌效果都較好，抑菌率都能達(dá)到95%以上；而乳酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和丙酸鈣對(duì)3種絲孢酵母菌株的抑菌效果存在明顯差異；富馬酸對(duì)3種絲孢酵母菌株的抑菌效果不佳，且不同菌株之間的抑菌率差異明顯。

2.2.4 黑曲霉菌株之間抑菌效果的比較

分別配制濃度為0.1 mg/mL的富馬酸、乳酸鈉、納他霉素、乳酸鏈球菌素、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚賴氨酸和丙酸鈣溶液添加到培養(yǎng)好的察氏液體培養(yǎng)基中，混合定容后取0.1 mL涂平板培養(yǎng)后計(jì)算抑菌率，考察對(duì)黑曲霉菌3種不同株之間的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 濃度為0.1 mg/mL的防腐劑對(duì)不同株黑曲霉菌的抑菌效果Fig.7 Bacteriostatic effect of preservatives of 0.1 mg/mL on different strains of Aspergillus niger

由圖7可知，只有對(duì)羥基苯甲酸丙酯對(duì)黑曲霉菌3的抑菌率達(dá)到100%；納他霉素、乳酸鏈球菌素、聚賴氨酸以及丙酸鈣對(duì)3株黑曲霉菌的抑菌率效果差異較大；富馬酸和乳酸鈉基本對(duì)黑曲霉菌沒(méi)有抑菌效果。

2.3 最低抑菌濃度的分析

7種食品防腐劑最低抑菌濃度的分析見(jiàn)表1。

表1 7種食品防腐劑對(duì)霉菌的MIC值Table 1 MICs of seven food preservatives against different species of mould mg/mL

由表1可知，納他霉素對(duì)11株霉菌都有很強(qiáng)的抑菌效果，在7種防腐劑中，它的最低抑菌濃度都是最小的；而富馬酸對(duì)各株菌的最小抑菌濃度明顯高于其他防腐劑，其抑菌效果在7種防腐劑中是最差的。

7種防腐劑最低抑菌濃度綜合排序?yàn)椋杭{他霉素＜乳酸鏈球菌素＜聚賴氨酸＜對(duì)羥基苯甲酸丙酯＜丙酸鈣＜乳酸鈉＜富馬酸。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)開(kāi)展了7種新型食品防腐劑對(duì)面制品中腐敗霉菌抑菌效果的比較研究試驗(yàn)。結(jié)果表明7種防腐劑對(duì)5種共11株霉菌都有不同程度的抑菌效果，含防腐劑溶液濃度越高其抑菌效果越好?？傮w來(lái)看，7種食品防腐劑抑菌效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋杭{他霉素＞乳酸鏈球菌素＞聚賴氨酸＞對(duì)羥基苯甲酸丙酯＞丙酸鈣＞乳酸鈉＞富馬酸。同一種防腐劑對(duì)于同種不同株的霉菌，其抑菌效果也不盡相同，甚至相差很大。因此，對(duì)于防腐劑的抑菌效果，不能單純以菌種來(lái)定論，應(yīng)具體到所涉及的每一株菌[25]。從抑菌效果排序可以看出，前三名都是生物類防腐劑，試驗(yàn)也進(jìn)一步證明了生物類防腐劑比化學(xué)類防腐劑更為高效、廣譜，因此，天然、安全的生物類防腐劑將是未來(lái)食品防腐領(lǐng)域的重點(diǎn)。