基于電子鼻與HS-SPME/GC-MS技術(shù)的香芋南瓜果實香氣物質(zhì)解析

李俊星，鐘玉娟，羅劍寧，王雯雯，黃文潔，史敬芳，黃河勛

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州 510640）（2.廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣東廣州 510640）（3.安捷倫科技（中國）有限公司，北京 100102）（4.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東廣州 510640）

南瓜為葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）的一類重要的園藝經(jīng)濟作物，中國南瓜（Cucurbita moschata）、印度南瓜（Cucurbita maxima）和美洲南瓜（Cucurbita pepo）是3個常見的具有經(jīng)濟價值的栽培種。盡管南瓜種類較多，但是絕大多數(shù)南瓜果實風(fēng)味不太吸引人。近年來，育種者選育出一類具有濃郁香味特征的南瓜品種-香芋南瓜，在田間或蒸煮過程中能散發(fā)出令人愉悅的類似芋香味，因此，香芋南瓜是進行南瓜香味性狀研究的理想材料。果實香氣成分的綜合分析能客觀地反映不同果實的風(fēng)味特點，是果實特征品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]，目前，國內(nèi)外針對南瓜新鮮果實、南瓜汁、南瓜籽以及南瓜籽油的香氣物質(zhì)研究已見報道，由于供試材料的差異，香氣組分結(jié)果也不盡相同[2～6]。中國南瓜（蜜本）果實共鑒定44種化合物，主要由烯類、醇類、酯類和醛類等物質(zhì)構(gòu)成，而印度南瓜（錦栗）果實共鑒定51種化合物，以羧基類、醇類、烷烴類為主，還有部分雜環(huán)類物質(zhì)[5]。因此，針對不同的供試材料，要充分了解其香氣揮發(fā)物的組成和含量，才能夯實香芋南瓜風(fēng)味性狀的基礎(chǔ)工作。

對于香氣物質(zhì)研究的主要手段有電子鼻、氣相色譜以及氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。電子鼻是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種實現(xiàn)快速分析氣味的儀器，具有檢測速度快、操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是用于快速判斷氣味狀況的便攜裝置[7,8]。電子鼻的分析結(jié)果呈現(xiàn)“模糊評價”特征，是對樣本整體香味特征進行比較，但是無法明晰具體的揮發(fā)性物質(zhì)成分。對于具體揮發(fā)性成分的鑒定，揮發(fā)性物質(zhì)的分離提取以及定性定量分析是其關(guān)鍵所在。目前香氣研究常采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（Headspace-solid phase micro/extraction combined with gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）。HS-SPME 提取技術(shù)已在柑橘[9,10]、草莓[11]等果實的香氣研究中得到了廣泛應(yīng)用。揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定由定性和定量分析組成，通過GC-MS可以有效鑒別大量揮發(fā)性物質(zhì)，同時進行定性和定量分析，極大地推動了香氣研究。近年來GC-MS已廣泛用于蘋果[12]、芒果[13]以及桃[14]等果實香氣物質(zhì)的檢測與鑒別研究。盡管GC-MS技術(shù)能夠?qū)颖局械膿]發(fā)性物質(zhì)進行定性和定量分析，但不能分析這些物質(zhì)作為一個整體時對樣本風(fēng)味的貢獻(xiàn)。因此，通過電子鼻和GC-MS的配合利用有利于從宏觀和微觀上全面研究供試樣本的風(fēng)味特征[15]。

因此，本研究以香芋南瓜成熟果實為研究材料，以非香芋南瓜為對照材料，首先利用電子鼻技術(shù)從整體風(fēng)味進行比較分析；其次利用 HS-SPME結(jié)合GC-MS對其揮發(fā)性物質(zhì)種類以及含量進行分析，通過不同南瓜材料的差異化合物分析初步明確香芋南瓜特有香氣組分，并分析了特有香氣成分在香芋南瓜果實不同發(fā)育階段含量變化。研究結(jié)果對香芋南瓜香味種質(zhì)資源挖掘和精準(zhǔn)鑒定、優(yōu)良品種選育以及南瓜產(chǎn)品的深加工均有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

本研究所用的植物材料都為本課題組自行選育，種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云基地。香芋南瓜材料編號為YJ，2類非香芋南瓜編號分別為EY和278，都為中國南瓜類型。化學(xué)試劑：C7～C40飽和正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品，美國 Supleco公司；3-壬酮，Alfa Aesar公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PEN3電子鼻，德國AIRSENSE公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Supleco公司；20 mL螺口頂空瓶，7890B氣相色譜串聯(lián) 7000D質(zhì)譜儀，7890A氣相色譜串聯(lián)5975C質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及預(yù)處理

供試南瓜品種于成熟期（授粉后約45 d）各3次生物學(xué)重復(fù)取樣，成熟果實取材于2016年11月。香芋南瓜不同發(fā)育階段果實取材于2017年5～7月，在YJ未授粉（W）、授粉后25天（25 d）以及授粉后55天(55 d)三個階段進行取樣，各個取樣時間3次生物學(xué)重復(fù)。取樣切片后立即液氮冷凍，放置-80 ℃保存。將-80 ℃保存的果實樣本進行冷凍干燥。待干燥充分后，將樣本研磨成粉，得到樣本干燥的粉樣，用于后期檢測。

1.2.2 電子鼻檢測

實驗采用PEN3電子鼻采集YJ和EY兩類南瓜資源的仿生嗅覺數(shù)據(jù)。傳感器列陣包含10個對不同類型氣體揮發(fā)物敏感的金屬氧化物氣敏傳感器，使得電子鼻系統(tǒng)能夠檢測不同的氣味。電子鼻采樣前，將每個重復(fù)10 g量放入100 mL燒杯中，密封，靜置1.5 h后采用電子鼻對其頂空氣體進行進樣。燒杯使用前均用超聲波清洗儀洗凈，放置陰涼、無異味的室內(nèi)環(huán)境晾干。電子鼻的采樣參數(shù)設(shè)置為：采樣時間間隔1 s，傳感器自動清洗時間100 s，傳感器歸零時間3 s，分析采樣時間 100 s，進樣準(zhǔn)備時間 3 s，進樣流量 190 mL/min。隨后提取電子鼻各傳感器特征值，利用PEN3傳感器配套的Winmuster軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）。

1.2.3 GC-MS檢測的香氣物質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱取1 g粉狀樣品，放入20 mL頂空瓶中，加入 1 μL 3-壬酮（0.04 μg/μL）作為內(nèi)標(biāo)，迅速擰緊頂空瓶瓶蓋，放入70 ℃水浴中。迅速插入固相微萃取裝置，平衡2 min，70 ℃吸附35 min。

1.2.4 香氣物質(zhì)的GC-MS檢測

吸附后，把萃取頭插入GC-MS的色譜儀的進樣口進行解吸附，進樣口溫度為270 ℃，解吸附時間為4.5 min。香芋南瓜成熟果實香氣物質(zhì)分析利用7890B氣相色譜串聯(lián)7000D質(zhì)譜儀對樣品揮發(fā)性成分進行數(shù)據(jù)采集。不同發(fā)育階段果實香氣物質(zhì)采集和分析利用7890A氣相色譜串聯(lián)5975C質(zhì)譜儀。

氣相條件：氣相色譜柱 DB-5MS；載氣為氦氣（99.999%），流速為1.0 mL/min；進樣模式為SPME手動進樣；進樣口溫度為270 ℃；程序化升溫：50 ℃保持3 min，隨后以5 ℃/min的速率上升至250 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：EI離子源；電離電壓70 eV；離子源溫度 230 ℃；四級桿溫度 150 ℃；接口溫度280 ℃；掃描模式為全掃，m/z35～450。

1.2.5 GC-MS數(shù)據(jù)分析

首先利用Masshunter定性分析軟件對香芋南瓜成熟果實采集到的全掃數(shù)據(jù)進行解卷積，在NIST 14標(biāo)準(zhǔn)譜庫中進行檢索，并根據(jù)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（C7-C40）提供的可靠信息計算保留指數(shù)，對鑒定得到的揮發(fā)性成分進行定性分析，標(biāo)準(zhǔn)為：（1）NIST14庫比對，質(zhì)譜匹配得分總分在70分以上；（2）保留指數(shù)偏差在10以內(nèi)，各化合物理論保留指數(shù)來自NIST 14庫。獲得香芋南瓜成熟果實的揮發(fā)性組分，揮發(fā)性化合物的相對含量，即通過各物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值計算的半定量估值。

香芋南瓜與非香芋南瓜果實中揮發(fā)性化合物的差異分析按如下步驟分析。首先利用Masshunter定性分析軟件進行解卷積。解卷積條件：保留時間窗口比例系數(shù)：100；信噪比閾值：2.0；剔除m/z為28的化合物。解卷積后的數(shù)據(jù)保存為.cef文件導(dǎo)入分析軟件Mass Profiler Professional（MPP）中進行分析，MPP化學(xué)計量學(xué)分析軟件對香芋南瓜和非香芋南瓜的果實GC-MS數(shù)據(jù)進行過濾和統(tǒng)計分析。利用過濾后的揮發(fā)性化合物通過MPP軟件進行主成分分分析（Principle Component Analysis，PCA），綜合反映不同樣本間的揮發(fā)性物質(zhì)差異。通過統(tǒng)計分析獲得差異化合物，對差異化合物進行定性，鑒定香芋南瓜成熟果實中的特有化合物。MPP過濾參數(shù)：最小絕對豐度：5000；組內(nèi)化合物最小出現(xiàn)頻率：60%；組內(nèi)最大變異系數(shù)：30%；統(tǒng)計分析參數(shù)：p＜0.05；最小差異倍數(shù)：2。

香芋南瓜果實的特有化合物在果實不同發(fā)育階段中的相對含量分析，以內(nèi)標(biāo)峰面積為參考，計算其相對含量（mg/kg干重）。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻對香芋南瓜和非香芋南瓜果實香味品質(zhì)分析

圖1 電子鼻對香芋南瓜和非香芋南瓜識別的PCA和LDA分析Fig.1 Electronic nose detection for Xiangyu pumpkin and non-Xiangyu pumpkin based on PCA and LDA

利用電子鼻從整體香味水平上對香芋南瓜和非香芋南瓜進行模糊評價。圖1為電子鼻對不同南瓜香味識別的PCA和LDA分析結(jié)果，通過PCA分析，其中第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率 85.00%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率為 6.16%，前兩個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到91.16%。隨后LDA分析結(jié)果顯示第1線性判別因子LD1的貢獻(xiàn)率為99.67%，第2線性判別因子LD2的貢獻(xiàn)率為0.04%，第1、2線性判別因子的累積貢獻(xiàn)率為99.71%。香芋南瓜YJ和非香芋南瓜EY樣本數(shù)據(jù)點之間無重疊，可以較好地進行識別分類。

2.2 香芋南瓜成熟果實揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定

利用GC-MS對香芋南瓜種質(zhì)YJ成熟果實的揮發(fā)性成分進行數(shù)據(jù)采集和分析，總離子色譜圖如圖2所示。經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫檢索和保留指數(shù)計算，共定性鑒別獲得了香氣物質(zhì)31種，其保留指數(shù)、相對含量、定性結(jié)果均列于表1。

從化合物分類上看，31種化合物主要包括醛、醇、酮、酯、含氮化合物、內(nèi)酯、苯及烯類等物質(zhì)，其中醛類物質(zhì)最多達(dá)到12種，總相對含量為0.0398 mg/kg干重，其次為酮類、含氮化合物和醇類，分別為6種、4種和4種，總相對含量分別為0.0044、0.0163和0.0050 mg/kg干重。

從單個化合物含量上來看，反式-2-己烯醛含量最高為0.0182 mg/kg干重，其次為2-乙?；?1-吡咯啉，相對含量為0.0133 mg/kg干重。

圖2 香芋南瓜果實揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖Fig.2 Representative GC-MS total ion chromatograms of volatile compounds from Xiangyu pumpkin

表1 香芋南瓜成熟果實中揮發(fā)性成分概括表Table 1 The volatile compounds in mature fruit of Xiangyu pumpkin

注：相對含量為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。

2.3 香芋南瓜與非香芋南瓜成熟果實揮發(fā)性物質(zhì)差異分析

圖3 不同樣本揮發(fā)性化合物主成分分析Fig.3 Score plot of principal compounds analysis using aroma compounds from different samples

分別收集香芋南瓜（YJ）和2類非香芋南瓜（EY和278）成熟果實的揮發(fā)性物質(zhì)，采集數(shù)據(jù)通過MPP分析軟件進行過濾及統(tǒng)計分析，將所得的差異化合物利用質(zhì)譜圖和保留指數(shù)進行定性。結(jié)果表明，YJ與EY相比較，兩者之間的揮發(fā)性成分通過PCA主成分分析，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為58.24%和19.91%（圖3）。最終獲得15種差異化合物，其中能定性10種化合物。YJ與278相比較，PCA結(jié)果表明其能解釋78.78%的變異（圖3）。獲得6種差異化合物，鑒定出3種差異化合物。

總體而言，主成分能夠充分保存樣品的原始數(shù)據(jù)信息，通過揮發(fā)性成分的PCA分析香芋南瓜和2類非香芋南瓜能夠較好地區(qū)分，說明香芋南瓜和非香芋南瓜果實之間存在揮發(fā)性物質(zhì)差異。YJ與EY之間10種差異化合物中有6種揮發(fā)性物質(zhì)僅在香芋南瓜果實中被檢測到，包括2-乙酰基-1-吡咯啉、2-乙?；量ⅵ?紫羅酮、反式6-壬烯醛、2,6-二甲基環(huán)己醇和a-紫羅酮（表2），而YJ與278之間的3種差異化合物有2種香芋南瓜特有的揮發(fā)性物質(zhì)，包括2-乙酰基-1-吡咯啉和苯甲醛。綜上分析，在兩組比較分析中，2-乙?；?1-吡咯啉(2-AP)是兩個比較組中共有的差異香氣成分。

表2 香芋南瓜與非香芋南瓜相比特有的揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 The unique volatile compounds in Xiangyu pumpkin compared with non-Xiangyu pumpkin

2.4 不同發(fā)育時期果實香氣特征成分變化

以3個果實不同發(fā)育時期樣本為試驗材料，分析了2-乙酰基-1-吡咯啉在不同發(fā)育階段的含量。結(jié)果表明，隨著果實成熟，2-乙?；?1-吡咯啉呈下降趨勢，該物質(zhì)在W和25 d的果實中含量相差不顯著，分別為0.0500和0.0500 mg/kg干重，但是在果實成熟后期55 d，該物質(zhì)含量降低顯著，為0.0200 mg/kg干重（圖4）。

圖4 果實不同發(fā)育階段2-乙?；?1-吡咯啉含量變化示意圖Fig.4 The abundance of 2-AP in the different development stage of fruit

3 結(jié)論

3.1 香芋南瓜具有特殊的濃郁香味，是一類適宜進行南瓜香味性狀分析的試驗材料。本研究利用了電子鼻技術(shù)的模糊評價特征，以及GC-MS技術(shù)對揮發(fā)性物質(zhì)精確鑒定的特性，綜合兩者的檢測結(jié)果，客觀判定香芋南瓜果實與非香芋南瓜果實的香味性狀差異。在前人研究中，利用電子鼻技術(shù)也能夠較好的區(qū)分中國南瓜、印度南瓜和美洲南瓜這三類南瓜資源[5]，說明其是一種比較有效的區(qū)分南瓜資源不同香味的分析手段。本研究的電子鼻PCA分析中，兩樣本間數(shù)據(jù)點無重疊（圖1），充分說明兩者之間整體風(fēng)味有顯著差異，電子鼻技術(shù)對于香芋南瓜與非香芋南瓜的區(qū)分效果是明顯的。

3.2 南瓜果實香氣物質(zhì)是由不同揮發(fā)性物質(zhì)組成的混合物，主要包括酯類、醛類、醇類、酸類、萜類和酮類等化合物[5]。本試驗采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對香芋南瓜成熟果實中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分析，共鑒定出31種揮發(fā)性物質(zhì)。其中醛類物質(zhì)種類及含量均為最高，醛類物質(zhì)具有較低的閾值，對風(fēng)味影響較大。醛類物質(zhì)中含量最高的為反式-2-己烯醛，具有清香味（http：//www.flavornet.org/），C6 以及 C9 的醇醛類物質(zhì)是清香型化合物的代表[16]。醛類物質(zhì)中的反,順-2,6-壬二烯醛是黃瓜特征香氣的最重要物質(zhì)[17]，具有強烈的紫羅蘭和黃瓜似香氣。含氮化合物中最重要的物質(zhì)是2-乙?；?1-吡咯啉，該化合物為香稻的特征香氣成分[18]，其在較低的含量時就能體現(xiàn)出強烈的風(fēng)味，呈現(xiàn)典型的花香、甜香，也有報道描述為典型的爆米花氣味。該物質(zhì)在南瓜子油中也被檢測到，并且呈現(xiàn)最高的風(fēng)味稀釋因子（flavor dilution factor）[3]，這說明在 2-乙?；?1-吡咯啉是這類特定南瓜子油的主要香味貢獻(xiàn)物。香芋南瓜果實揮發(fā)性物質(zhì)的種類與含量鑒定結(jié)果與前人研究結(jié)果相比較有比較大的差異，周春麗等[5]對中國南瓜（蜜本南瓜）的香氣物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)含量最高的為酯類和醇類化合物，且并沒有檢測到含氮化合物，這可能是與香芋南瓜獨特的濃郁香味有關(guān)在果實眾多香氣物質(zhì)中，一種或幾種關(guān)鍵揮發(fā)性化合物賦予特殊的香味屬性，稱之為香味主要貢獻(xiàn)物，這些成分對果實風(fēng)味其主要作用[19]。因此，從諸多揮發(fā)性物質(zhì)中鑒定出香芋南瓜成熟果實香味主要貢獻(xiàn)物，對后續(xù)香芋南瓜香味性狀的解析至關(guān)重要。本研究通過比較香芋南瓜和非香芋南瓜成熟果實的揮發(fā)性成分，利用化學(xué)計量學(xué)首先對二者的化合物進行數(shù)據(jù)過濾和統(tǒng)計分析，得到香芋南瓜果實中特有的揮發(fā)性化合物。該技術(shù)的運用對數(shù)據(jù)進行嚴(yán)格的過濾，保證了最終用于分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，并且相較前人研究減輕了化合物定性分析的工作量，只需對差異化合物進行定性。另外，主成分分析（PCA）的結(jié)果表明揮發(fā)性化合物能很好的將香芋南瓜和非香芋南瓜進行區(qū)分（圖3），并且貢獻(xiàn)率接近或達(dá)到80%，主成分能夠充分保存樣本的原始數(shù)據(jù)信息。GC-MS技術(shù)是對樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的具體種類和含量進行檢測和比較，也顯示兩者之間揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量呈現(xiàn)顯著性不同，這一結(jié)果與電子鼻分析結(jié)果基本一致，GC-MS的分析結(jié)果有利于對電子鼻分析的結(jié)果解釋。

3.3 通過2組比較（表2），我們獲得2-乙?；?1-吡咯啉為香芋南瓜果實特有的香氣物質(zhì)，我們推測其為香芋南瓜的香味主要貢獻(xiàn)物。該物質(zhì)在非香芋南瓜成熟果實中都沒有檢測到，并且該化合物在香芋南瓜成熟果實的揮發(fā)性成分中含量非常高（表1）。此外，通過該化合物在果實不同發(fā)育時期研究發(fā)現(xiàn)，其在未授粉果實中含量最高，在授粉25 d該化合物的含量基本不變，保持在較高的水平，這與大部分香氣物質(zhì)出現(xiàn)在果實發(fā)育后期的結(jié)論有差異[20]。在大部分水果果實香氣研究中發(fā)現(xiàn)，在果實發(fā)育的不同時期，主要香氣物質(zhì)含量存在顯著差異[21～24]。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)，2-乙?；?1-吡咯啉在授粉后55 d果實成熟后期中含量急劇降低，這與田間嗅覺經(jīng)驗相匹配。2-乙?；?1-吡咯啉在香芋南瓜果實中的變化趨勢，與該物質(zhì)在香稻葉片中的研究結(jié)果一致，其在香稻葉片中表現(xiàn)為葉尖含量高于葉片基部，嫩葉含量明顯高于老葉含量[25]。這可能是由于伴隨著果實衰老，該化合物合成減少而揮發(fā)增加導(dǎo)致的。通過了解香芋南瓜果實中 2-AP在不同發(fā)育階段的含量，可為果實采摘時機的選擇提供理論基礎(chǔ)。