南極磷蝦過敏原的超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜方法檢測(cè)

李紫薇，張曉梅，胡玲萍，李兆杰，張鴻偉，薛長湖

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）（2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島 266002）

南極磷蝦（Euphausia superba），又稱大磷蝦或南極大磷蝦[1]，屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼亞門磷蝦目磷蝦科，廣泛分布于環(huán)南極海域，在南極生態(tài)系統(tǒng)中起到了十分重要的作用。南極磷蝦的資源蘊(yùn)藏量巨大，據(jù)估計(jì)在6.5～10億噸之間[2]，至今漁獲總量已超過600萬噸[3]。有學(xué)者稱，若以生物質(zhì)能來算，南極磷蝦可被譽(yù)為“世界上最成功的物種”[4]。因其生物量巨大，南極磷蝦是人類重要的食物資源寶庫，其不僅是人類目前發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)含量最高的生物（蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%以上）[4]，含有7種人體必需氨基酸，同時(shí)還富含以EPA和DHA為代表的ω-3系不飽和脂肪酸[5]。此外，磷蝦肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗胃潰瘍的藥用價(jià)值[6]。十九大以來，我國致力于打造藍(lán)色海洋強(qiáng)國，大力開發(fā)海洋資源，南極磷蝦作為南極海域中資源量最大的生物物種，其開發(fā)利用前景十分廣闊。

飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF-MS）是一種基于高效離子淌度技術(shù)的高性能質(zhì)譜[16]，選擇性和靈敏度很高，可以方便快速進(jìn)行篩查鑒定。超高效液相色譜（UPLC）與常規(guī)高效液相色譜(HPLC)相比，有著更高的分離效率、分辨率、靈敏度和峰容量[17]，目前在代謝產(chǎn)物高通量篩選，痕量物質(zhì)分析以及復(fù)雜生物樣本分析中有著廣泛應(yīng)用[18～20]。超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS）在復(fù)雜化合物的分析鑒定中有著巨大作用，在過敏原檢測(cè)上的應(yīng)用十分廣泛。三重四極桿質(zhì)譜有著高的靈敏度和重現(xiàn)性，也為過敏原蛋白的鑒定提供了重要的手段。本研究利用超高液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和三重四極桿質(zhì)譜對(duì)南極磷蝦中過敏原進(jìn)行檢測(cè)，以期為食品中過敏原的檢測(cè)提供一種快速簡便的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦，遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（比活18523 U/mg），美國Promega公司；色譜級(jí)甲酸，美國Sigma公司；色譜級(jí)乙腈，美國Fisher公司；碘代乙酰胺，美國Sigma公司；Folin-酚乙液，北京索萊寶科技有限公司；二硫蘇糖醇、尿素、碳酸氫銨、碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅、牛血清蛋白，均為分析純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Nexera X2 30A超高效液相色譜儀，日本島津公司；AB SCIEX Triple TOF? 5600質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；Triple QuadTM 5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；MQS50001型超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；AB135-S型精密電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；A11分析研磨機(jī)，德國IKA公司；CR21G II高速冷凍離心機(jī)，日本CHTACHI公司；超濾離心管UFC501008，美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南極磷蝦蛋白提取

用液氮將冷凍南極磷蝦肌肉研磨至粉末狀。稱取蝦粉1.00 g，加入10.00 mL蛋白提取液（8 mol/L尿素，50 mmol/L NH4HCO3），垂直震蕩30 min，4 ℃，15000 r/min低溫高速離心20 min，取上清，待下步測(cè)定蛋白含量。

1.2.2 Folin-酚法測(cè)定提取液蛋白含量

Folin-酚甲液由A液和B液5：1混合而成，臨用時(shí)現(xiàn)配（A液：10.00 g碳酸氫鈉，2.00 g氫氧化鈉，0.25 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水；B液：0.25 g五水硫酸銅溶于100 mL蒸餾水水中），乙液為商品化試劑。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取6支試管，分別加入0、200、400、600、800、1000 μL mg/mL的BSA溶液，用蒸餾水補(bǔ)足到1.00 mL。每管加入Folin-酚甲液5.00 mL，搖勻，于25 ℃靜置10 min。每管加入Folin-酚乙液0.50 mL，迅速搖勻，30 ℃靜置30 min，以蒸餾水為空白，在650 nm處比色測(cè)吸光值。樣品蛋白含量測(cè)定如標(biāo)曲配制，取樣量為1.00 mL，分別為原液和梯度稀釋10倍、100倍、1000倍的樣品。

1.2.3 胰蛋白酶酶解蛋白提取液

將上述蛋白提取液分為三份，均各取 100 μL上清，分別加入2 μL 1 mol/L二硫基蘇糖醇，60 ℃條件下反應(yīng)1 h。取5.00 μL、1 mol/L碘代乙酰胺（現(xiàn)配），加入至已冷卻至室溫的上述反應(yīng)液中，避光室溫反應(yīng)1 h。采用10 K超濾離心管在15000 r/min離心超濾20 min后，用200 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液洗滌膜上層蛋白，共洗滌三次。將胰蛋白酶溶液按酶底比1：50加入至上述蛋白溶液中，37 ℃酶解16 h，使酶解徹底。再用超濾離心管15000 r/min離心超濾20 min，收集下層肽段。

磁性纖維素對(duì)亞甲基藍(lán)的吸附過程受吸附反應(yīng)溫度、溶液pH值和吸附時(shí)間的影響，吸附的最佳實(shí)驗(yàn)條件是反應(yīng)溫度293 K；溶液pH值為7；吸附時(shí)間120 min。磁性纖維素對(duì)亞甲基藍(lán)的吸附動(dòng)力學(xué)特征用準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合較好；等溫吸附以Langmuir擬合最佳，由此可得磁性纖維素對(duì)亞甲基藍(lán)最大理論吸附容量為123.15 mg·g-1。

1.2.4 南極磷蝦中過敏原的分離和檢測(cè)

采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)對(duì)南極磷蝦中的過敏原分離和檢測(cè)。液相色譜和質(zhì)譜條件色譜柱：安捷倫AdvanceBio Peptide Map column (150 mm×2.10 mm，130 ?，2.70μm)；柱溫：40 ℃。流動(dòng)相A：0.10%甲酸-乙腈，流動(dòng)相B：0.10%甲酸-水；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：30 μL；梯度洗脫時(shí)間：46.00 min；流動(dòng)相梯度：0～2.00 min（95%B），2.00～17.00 min（95%～80%B），27.00～37.00 min(85%～65%B) ， 37.00～39.00 min（65%～20%B），39.00～42.00 min（20%～95%B），42.00～46.00 min（95%B）。質(zhì)譜掃描范圍：350～1500 u，正離子反應(yīng)模式，霧化氣 GS1：35 psi，輔助加熱器GS2：45 psi，氣簾氣壓35 psi，噴霧電壓5500 eV，離子源溫度：500 ℃，解簇電壓：100 V，碰撞能量：10 eV，信號(hào)強(qiáng)度閾值：2e4。高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜（HPLC-QQQ-MS），液相色譜條件：色譜柱及流動(dòng)相同 UPLC-QTOF-MS；柱溫：40 ℃，流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相梯度：0～0.50 min，5%B；0.50～17.00 min，5%～35%B；17.00～17.50 min，35%～95% B；17.50～20.00 min，95% B；20.00～20.10 min，95%～5% B；20.10～25.00 min，5% B。正離子模式，噴霧電壓為5500 V，霧化氣為35 psi，離子源溫度為575 ℃。解簇電壓和碰撞能量由Skyline軟件來優(yōu)化，駐留時(shí)間設(shè)為5.00 ms。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將計(jì)算機(jī)采集的肽段質(zhì)荷比、保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度等數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成wiff文件，導(dǎo)入Protein PilotTMSoftware，選用 NCBI的南極磷蝦數(shù)據(jù)庫（NCBI-Euphausua superba.fasta）進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索。Protein Pilot軟件參數(shù)設(shè)置如下：搜庫方法：Paragon method；消化：Trypsin；儀器：TripleTOF 5600；物種：None；ID Focus：Amino acid Subtitutions，Biological modifications；Search Effort：Thorough ID；檢測(cè)蛋白質(zhì)閾值（Unused Protscore（conf））：＞0.05%（10.00%）；提交錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery rate analysis，F(xiàn)DR）分析報(bào)告。

2 結(jié)果與討論

2.1 南極磷蝦提取液蛋白含量的測(cè)定2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1 蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Protein content

以蛋白含量為橫坐標(biāo)，650 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，線性回歸方程為：y=3.0286x-0.0075（R2=0.9993），繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2.1.2 南極磷蝦提取液中蛋白含量計(jì)算

為了準(zhǔn)確測(cè)定南極磷蝦提取液的蛋白含量，必須使吸光度在線性范圍內(nèi)，因此采用了稀釋100倍的樣品（稀釋一百倍的誤差，是非常大的，要給出誤差范圍），測(cè)得650 nm處的吸光值為0.718，換算成提取液蛋白含量為24 mg/mL。

2.2 南極磷蝦蛋白提取液胰蛋白酶降解產(chǎn)物的UPLC-Q-TOF-MS分析

圖2 南極磷蝦胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的UPLC-Q-TOF-MS代表性總離子流色譜圖Fig.2 Representative total ion current (TIC) chromatogram of UPLC-Q-TOF-MS of trpsin digested peptides of Antarctic krill

按上述 1.2.4項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件所得的南極磷蝦胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的有代表性的總離子流色譜圖見圖2。

由圖2可見，使用UPLC-QTOF對(duì)南極磷蝦蛋白提取液胰蛋白酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測(cè)，其得到的譜圖峰型對(duì)稱，譜峰尖銳，數(shù)據(jù)采集狀況良好，譜圖重現(xiàn)性好。

2.3 南極磷蝦過敏原及主要肽段的鑒定

南極磷蝦胰蛋白酶降解產(chǎn)物經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)的數(shù)據(jù)在ProteinPilot軟件中用NCBI南極磷蝦蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜庫。

在95%的置信度下，南極磷蝦酶解產(chǎn)物中共鑒定到222條多肽，對(duì)應(yīng)的蛋白種類為28種，表1列舉了鑒定得到的代表性蛋白信息和相應(yīng)肽段數(shù)目。其中原肌球蛋白和精氨酸激酶為南極磷蝦中兩種常見的過敏原，對(duì)應(yīng)的肽段條數(shù)分別為74和44。表2列出了南極磷蝦中兩種主要過敏原對(duì)應(yīng)的響應(yīng)強(qiáng)度最高的6條肽段。

表1 南極磷蝦中鑒定的主要蛋白及肽段數(shù)目Table 1 Primary protein and peptide amount of Antarctic krill

表2 南極磷蝦中的過敏原及代表性肽段Table 2 Allergens of Antarctic krilland representative peptides

2.4 南極磷蝦主要過敏原代表性肽段的三重四級(jí)桿驗(yàn)證

為進(jìn)一步準(zhǔn)確驗(yàn)證過敏原肽段，提高結(jié)果重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)利用三重四極桿多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)代表性肽段進(jìn)行驗(yàn)證。使用生物信息學(xué)軟件Skyline對(duì)每個(gè)過敏原響應(yīng)強(qiáng)度最高的6個(gè)肽段進(jìn)行模擬酶解，產(chǎn)生傳輸離子對(duì)，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)鑒定肽段并表征過敏原蛋白。

圖3 肽段LQTLENDLDQVSEALLK的提取離子色譜圖Fig.3 Representative extracted ion chromatogram (XIC) scan spectra of peptide LQTLENDLDQVSEALLK

圖4 肽段LQTLENDLDQVSEALLK的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary ion mass spectrometry (SIMS) of peptide LQTLENDLDQVSEALLK

表3列出了南極磷蝦主要過敏原代表性肽段的傳輸離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的碰撞能量（CE）和解簇電壓（DP）值，選取兩個(gè)代表性肽段作為例證。

圖 3和圖 4分別為南極磷蝦過敏原代表性肽段LQTLENDLDQVSEALLK的提取離子色譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖，母離子為 644.01，子離子分別為 1002.55、887.52、759.46、660.39、815.38，其保留時(shí)間為16.38 min。TropomyosinSEQ ID：

MDAIKKKMQAMKMEKDSAMDRSDALEAQN KETNAKADKADDEVHNLQKRLQTLENDLDQVS EALLKANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNRRIQLL EEDLERSEERLNTATTKLAEASQAADESERMRKV LENRSMLDEERMDALESQLKEARLLAEEADRKY DEVARKLAMVEADLERAEERAEAGENKIVELEEE LRVVGNNLKSLEVSEEKANQREEAYKEQIKHLTH KLKTAEARAEFAERSVQKLQKEVDRLEDELVNEK EKYKGITDELDQTFNELSGY

表3 Skyline預(yù)測(cè)的南極磷蝦過敏原代表性肽段解簇電壓和碰撞能量Table 3 The declustering potential and collision energy values of representative peptide of Antarctic krill predicted by Skyline

圖5 肽段GNINEGVPVHSVR的提取離子色譜圖Fig.5 Representative extracted ion chromatogram (XIC) scan spectra of peptide GNINEGVPVHSVR

圖6 肽段GNINEGVPVHSVR的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 Secondary ion mass spectrometry (SIMS) of peptide GNINEGVPVHSVR

圖 5和圖 6分別為南極磷蝦過敏原代表性肽段GNINEGVPVHSVR的提取離子色譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖，其母離子為 703.87，子離子分別為 1122.59、1007.56、361.22、285.16、400.18，其保留時(shí)間為7.63 min。

Arginine kinase SEQ ID：

MGYSEVELIQQMIAAINKLGVEDTVLQPKYRI ADIPPYPEIKSVDSLVAKYVSQKVWSKLAGHKTKT SGFTLSQAIACAVEFDNQHCGIYAGDWDSYKDFA DIFDPLIQEYHGLEPNAVHTTDMDASKIKGNINEG VPVHSVRIRVGRSIDGYGLSPGITKEQRLAVEEMM KNGFTKLKGDLAGNYYPLSDMDEKVRQQLVDDH FLFMSGDPNLQVAGMERDWPEGRGIFHNEAKTFL VWVNEEDQLRIISMEKGGNVKGVFERLASGIRAV GDSVWTECGKEFACDPKYGYIHSCPTNLGTGMRA SVHVDLPGWAKEGMDALKKRCEELKVQPRGTKG ESGGVTGHTFDISNKHRLGYSEVELVQCMIDGVN TLHAEDMELQKKHGAGA

3 結(jié)論

本研究利用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)南極磷蝦過敏原進(jìn)行檢測(cè)，鑒定出了南極磷蝦體內(nèi)兩種主要過敏原即原肌球蛋白和精氨酸激酶，對(duì)應(yīng)的肽段條數(shù)分別為74和44條，并通過Skyline生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行模擬酶切，在三重四極桿多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。這種方法快速簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好。突破了傳統(tǒng)生物檢測(cè)技術(shù)操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)冗長，成本較高的障礙，為食品安全和水產(chǎn)品市場(chǎng)提供了有利的檢測(cè)技術(shù)，也為后期過敏原的消減提供了理論基礎(chǔ)，為我國國民健康提供了有效的幫助。