頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS測(cè)定醬油中的羥甲基糠醛衍生物

萬(wàn)博愷，李丹丹，倪輝,2,3，楊遠(yuǎn)帆,2,3，黃高凌,2,3

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021）（2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361021）（3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

羥甲基糠醛是含糖食品的常見(jiàn)成分，它是糖熱降解和美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物[1,2]；并且容易熱分解產(chǎn)生糠醛、2-乙基-1-己醇和 5-甲基糠醛等衍生物[3]。其中，糠醛與 2-乙基-1-己醇在我國(guó)是允許使用的食品香料[4]，而 5-甲基糠醛是一種允許使用的食品添加劑[5]。但是，它們的過(guò)量使用都存在一定的安全隱患，如近年我國(guó)某醫(yī)院的一個(gè)病例[6]，由于病人攝入大量糠醛類物質(zhì)，導(dǎo)致其出現(xiàn)胸口痛、嘔吐、抽筋、無(wú)法正常進(jìn)食等癥狀。因此，對(duì)于食品中羥甲基糠醛及其衍生物含量進(jìn)行監(jiān)控及安全性評(píng)價(jià)是食品安排檢測(cè)的重要內(nèi)容。

醬油作為我們?nèi)粘Ｉ钪兴荒苋鄙俚囊环N調(diào)味品，深受大家喜歡。它是一種以大豆或脫脂大豆、淀粉、小麥和食鹽等材料，經(jīng)過(guò)制油、發(fā)酵制成的具有特殊色、香、味的液體調(diào)味品[7,8]，其組成成分包括食鹽、糖類、氨基酸、有機(jī)酸、色素及香料等[9]。相關(guān)研究對(duì)醬油中的羥甲基糠醛的含量進(jìn)行的一些分析研究，但尚未針對(duì)其衍生物進(jìn)行系統(tǒng)研究。羥甲基糠醛衍生物分子質(zhì)量小，濃度低，揮發(fā)性強(qiáng)，其定量易容易受到醬油基質(zhì)的干擾，因此需要進(jìn)行細(xì)致的樣品前處理才能進(jìn)行儀器分析[10]。近年來(lái)，肖昭競(jìng)[11]等研究發(fā)現(xiàn)頂空固相微萃取法（Head Space-Solid Phase Microextraction，HS-SPME）提取醬油中的揮發(fā)性成分（包括羥甲基糠醛）比液-液萃取技術(shù)（Liquid-Liquid Extraction，LLX）等樣品前處理方式的結(jié)果更好。相歡等[12]也發(fā)現(xiàn)HS-SPME的樣品前處理方法對(duì)醬油中各物質(zhì)的萃取較為全面。

因此，為了評(píng)估醬油中羥甲基糠醛衍生物的含量及安全性，本文收集不同工藝生產(chǎn)的醬油產(chǎn)品，采用HS-SPEM萃取、GC-MS分析的方法測(cè)定其中的羥甲基糠醛衍生物含量，為探究醬油中羥甲基糠醛衍生物的含量差異及對(duì)消費(fèi)者健康的影響提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、原料與儀器

古早醬油，海堤超級(jí)老抽，海堤特級(jí)生抽，海堤超級(jí)醬油，海堤精選醬油均購(gòu)于廈門本地商場(chǎng)。

正構(gòu)烷烴(C8-C20)、環(huán)己酮、糠醛、2-乙基-1-己醇、5-甲基糠醛、正己烷均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；羥甲基糠醛購(gòu)于南京愛(ài)里凱德化工有限公司。

QP-2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和 Rtx-5MS（60 m×0.32 mm×0.25 μm）色譜柱購(gòu)于日本島津公司；57330-U手動(dòng)SPME進(jìn)樣器和75 μm CAR/PDMS萃取頭購(gòu)于美國(guó)Supelco公司；Labostar 7 TWF UV超純水機(jī)購(gòu)于德國(guó)西門子；RO-03A制冰機(jī)購(gòu)于深圳市日歐制冷設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的分析操作條件

將固相微萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口中解吸附 3 min，載氣的流量為3 mL/min，老化30 min。取25 mL水置于50 mL萃取瓶中，加入5 mL待測(cè)樣品，再加入1 μg/mL的環(huán)己酮10 μL作為內(nèi)標(biāo)，然后將萃取瓶置于60 ℃水浴鍋中平衡5 min后，將已老化的萃取頭插入萃取瓶中，吸附20 min。吸附完成后，將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口中解吸附 3 min，按照如下操作進(jìn)行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱為 Rtx-5MS（60 m×0.32 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（純度99.999%），柱流量為3 mL/min，分流比為1：5。

升溫程序：初始溫度為40 ℃并保持1 min，然后以5 ℃/min升溫至220 ℃后保持1.5 min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為250 ℃，電離方式為EI，電離能量為70 eV，質(zhì)譜接口溫度為250 ℃，SCAN模式掃描，離子碎片掃描范圍在33～450m/z之間。

1.2.2 醬油中羥甲基糠醛衍生物的鑒定

對(duì)揮發(fā)性成分共采用了三種方式進(jìn)行定性：

（1）利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）進(jìn)行相似度檢索、特征峰分析；

（2）通過(guò)正構(gòu)烷烴計(jì)算待測(cè)物的保留指數(shù)，并參考有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)進(jìn)行綜合定性；

（3）與標(biāo)準(zhǔn)品的特征離子碎片和保留指數(shù)進(jìn)行比較定性。

1.2.3 羥甲基糠醛衍生物的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋采用內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行梯度稀釋，內(nèi)標(biāo)為0.33 μg/mL的環(huán)己酮溶液。根據(jù)1.2.1節(jié)色譜條件、升溫程序和質(zhì)譜條件，在質(zhì)譜SIM模式下進(jìn)行分析。以糠醛、2-乙基-1-己醇和5-甲基糠醛含量為1、2、5、25、50、100、200 μg/mL 對(duì)糠醛、2-乙基-1-己醇、5-甲基糠醛和環(huán)己酮峰面積比繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 方法檢測(cè)限和定量限

在GC-MS儀器中，信噪比通常作為衡量靈敏度的尺碼，也是GC-MS儀器的一個(gè)重要指標(biāo)[13]。信噪比指標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在儀器上所出峰高與儀器的基線噪聲之比，將最低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液再向下稀釋，直到信噪比≥3時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為檢測(cè)限，而信噪比≥10時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為定量限[14]。

取5 mL空白樣品，添加1 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（糠醛、2-乙基-1-己醇、5-甲基糠醛混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，10 μg/mL）和10 μL 1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)環(huán)己酮溶液，逐倍稀釋至信噪比≥10和信噪比≥3。

1.2.5 方法回收率

在測(cè)定樣品的同時(shí)，于同一樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，所得加標(biāo)試樣測(cè)量值與原樣值和加標(biāo)值和之比即為回收率，回收率的大小可反應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性[15]。

選擇羥甲基糠醛衍生物含量較低的海堤超級(jí)醬油作為回收率測(cè)定樣品。取25 mL醬油樣品四份，分別添加4 個(gè)濃度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，通過(guò)測(cè)定羥甲基糠醛衍生物的含量，計(jì)算樣品中羥甲基糠醛衍生物的回收率?；厥章实挠?jì)算見(jiàn)式（1-1）。

回收率(%)=100×測(cè)量值/(原樣值+加標(biāo)值) （1-1）

1.2.6 方法準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度是體現(xiàn)測(cè)量值與實(shí)際值之間符合程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)，通常用相對(duì)誤差表示。而精確度是評(píng)價(jià)方法重復(fù)性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，通常用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來(lái)表示。通過(guò)日內(nèi)和日間所測(cè)物的含量變化來(lái)評(píng)價(jià)定量方法的準(zhǔn)確度和精密度，從而反映樣品的穩(wěn)定性。日內(nèi)變化是同一天測(cè)定3組平行混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算其含量和誤差。日間變化是連續(xù)3 d測(cè)定同一個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每天測(cè)定一次，計(jì)算含量和誤差。準(zhǔn)確度的計(jì)算見(jiàn)式（1-2）。

準(zhǔn)確度(%)=100×(測(cè)量值的平均值/理論值) （1-2）

1.2.7 醬油中羥甲基糠醛衍生物含量的測(cè)定

運(yùn)用本文建立的HS-SPME/GC-MS分析方法，采用加內(nèi)標(biāo)校正的外標(biāo)法作為定量方法。對(duì)醬油樣品中三種羥甲基糠醛衍生物進(jìn)行檢測(cè)分析，重復(fù)檢測(cè)3次。三種羥甲基糠醛衍生物分別通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

通過(guò) Excel 2013(微軟，美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SPSS 19.0軟件對(duì)不同醬油中羥甲基糠醛衍生物的含量進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種醬油中羥甲基糠醛衍生物的鑒定

圖1 五種醬油樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) of the volatiles in different sauce samples

對(duì)不同醬油樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行GC-MS分析，得到揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖（圖1）。根據(jù)相似度檢索、特征離子碎片分析和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，從五種醬油中鑒定出糠醛、2-乙基-1-己醇和5-甲基糠醛這3種羥甲基糠醛衍生物（表1）。

相關(guān)研究表明，羥甲基糠醛在酸性條件下熱分解產(chǎn)生糠醛和5-甲基糠醛等衍生物[16]。此外，肖昭競(jìng)等[11]用 HS-SPME/GC-MS方法在幾種市售醬油中均檢測(cè)到糠醛、5-甲基糠醛與2-乙基-1-己醇。本研究結(jié)果與前人鑒定出醬油中羥甲基糠醛衍生物具有一致性。

表1 五種醬油樣品揮發(fā)成分的鑒定結(jié)果Table 1 Identification of volatile components in different soy sauce samples

2.2 五種醬油中羥甲基糠醛衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定及靈敏度

以內(nèi)標(biāo)法定量，對(duì)三種羥甲基糠醛衍生物進(jìn)行定量分析，對(duì)其在3.33～666.67 μg/mL范圍內(nèi)建立相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，糠醛、2-乙基-1-己醇、5-甲基糠醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為 Y=0.0148X-0.757，Y=0.128X-7.935，Y=0.00799X-1.700，各回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.990，說(shuō)明這3種羥甲基糠醛衍生物在線性范圍內(nèi)線性良好。另外，三種羥甲基糠醛衍生物的檢測(cè)限及定量限如表2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-乙基-1-己醇的檢測(cè)限明顯低于其它兩種衍生物，這可能與2-乙基-1-己醇的沸點(diǎn)有關(guān)，2-乙基-1-己醇沸點(diǎn)小，易揮發(fā)。三種羥甲基糠醛衍生物的檢測(cè)限均小于3.33×10-1μg/L，定量限均小于 3.33 μg/L。而林曉珊[20]等利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)調(diào)味品中糠醛類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，其方法的檢測(cè)限為5 μg/kg，本方法與之相比靈敏相似。

表2 方法檢測(cè)限和定量限Table 2 Detection limit and quantitation limit of analysis method

2.3 方法回收率

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，考慮到樣品中糠醛和2-乙基-1-己醇含量相對(duì)較低且相差不大，其回收率應(yīng)選擇加標(biāo) 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL進(jìn)行計(jì)算，5-甲基糠醛含量相對(duì)較高，其回收率應(yīng)選擇加標(biāo) 50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL 進(jìn)行計(jì)算。對(duì)各醬油原樣進(jìn)行回收率測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，三種羥甲基糠醛衍生物回收率范圍在 123.93%～285.52%間（表3～5）。而根據(jù)GB/T 27404《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》[21]，當(dāng)被測(cè)組分含量小于0.1 mg/kg時(shí)，其回收率范圍應(yīng)在60%～120%之間，可能是由醬油樣品基質(zhì)復(fù)雜導(dǎo)致，故將原樣品進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)稀釋5倍后，三種羥甲基糠醛衍生物的回收率范圍在82.23%～115.04%（表3～5）之間，符合GB/T 27404檢測(cè)要求。因此，確定對(duì)醬油樣品用蒸餾水稀釋5倍后再進(jìn)行SPME萃取及GC-MS分析流程。

2.4 方法準(zhǔn)確度和精密度

羥甲基糠醛衍生物的準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定結(jié)果如表 6所示，3種化合物日內(nèi)的準(zhǔn)確度范圍在93.31%～111.50%之間，日間的準(zhǔn)確度范圍在93.02%～115.91%之間，日內(nèi)的精密度≤4.36%，日間的精密度≤8.02%。而林曉珊[20]等人利用GC-MS研究調(diào)味品中的糠醛類物質(zhì)，其日內(nèi)精密度≤5%，由此可見(jiàn)本方法的準(zhǔn)確度和精密度可靠。

表3 醬油中糠醛稀釋前后的回收率Table 3 Recovery of furfural in soy sauce (undiluted and after dilution)

表4 醬油中5-甲基糠醛稀釋前后的回收率Table 4 Recovery of 5-methylfurfural in soy sauce (undiluted and after dilution)

表5 醬油中2-乙基-1-己醇稀釋前后的回收率Table 5 Recovery of 2-ethyl-1-hexanol in soy sauce (undiluted and after dilution)

表6 方法準(zhǔn)確度和精密度Table 6 Accuracy and precision of analysis method

2.5 五種醬油中羥甲基糠醛衍生物含量的測(cè)定

通過(guò)對(duì)五種市售醬油樣品中羥甲基糠醛衍生物進(jìn)行定量分析可知（表7），糠醛在海堤精選醬油中含量高達(dá)98.75 μg/L，而在海堤超級(jí)醬油（70.14 μg/L）中含量最低；2-乙基-1-己醇在海堤精選醬油中含量最高，為79.20 μg/L，在海堤超級(jí)醬油中含量最低，為66.61 μg/L；5-甲基糠醛在海堤超級(jí)老抽（527.40 μg/L）中含量最高，在海堤超級(jí)醬油（226.83 μg/L）中含量最低。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)海堤超級(jí)老抽中3種羥甲基糠醛衍生物的含量均較高，而海堤超級(jí)生抽中羥甲基糠醛衍生物的含量則較低。這可能與兩種醬油的生產(chǎn)工藝密切相關(guān)，由于老抽的發(fā)酵時(shí)間較一般醬油要長(zhǎng)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，5-羥甲基糠醛含量會(huì)逐漸上升[22]。另外，有研究顯示5-羥甲基糠醛在加工和貯藏過(guò)程中會(huì)熱分解生成衍生物，因此海堤超級(jí)老抽中的羥甲基糠醛衍生物含量明顯高于發(fā)酵時(shí)間較短的海堤超級(jí)生抽及其他醬油。羥甲基糠醛衍生物的安全攝入量參考Klaus等[23]人對(duì)5-羥甲基糠醛毒性和風(fēng)險(xiǎn)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)五種醬油中羥甲基糠醛衍生物含量遠(yuǎn)低于其安全攝入量，即以正常成年人體重60 kg計(jì)算，每天攝入羥甲基糠醛衍生物 5.8～6.0 g以上才會(huì)引起不良反應(yīng)，以羥甲基糠醛衍生物含量最高的海堤超級(jí)老抽為例計(jì)算，每天至少需要食用8345.4 L以上醬油才會(huì)引起不良反應(yīng)，故日常食用醬油的量是安全的。

表7 五種市售醬油中羥甲基糠醛衍生物的測(cè)定結(jié)果Table 7 Five commercially available sample results of HMF derivatives

3 結(jié)論

本文應(yīng)用HS-SPME結(jié)合GC-MS的方法對(duì)醬油中的羥甲基糠醛衍生物進(jìn)行分析測(cè)定。從5種市售醬油中鑒定出糠醛、5-甲基糠醛和2-乙基-1-己醇這3種羥甲基糠醛衍生物；確定樣品前處理工藝為稀釋5倍后進(jìn)行SPME萃取及GC-MS分析；不同醬油中3種羥甲基糠醛衍生物的含量差異顯著，其中糠醛含量范圍在 70.14～98.75 μg/L，5-甲基糠醛含量在221.87～527.40 μg/L之間，2-乙基-1-己醇含量在66.61～79.20 μg/L 之間，但正常食用醬油的量不足以導(dǎo)致安全隱患。