青天葵甲醇提取物的體外抗氧化活性

周燕園，劉清華，嚴(yán)火連，常慧敏，陳思蓉，宋家樂(lè),3,4

（1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541100）（2.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541100）（3.廣西高校預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541100）（4.CHA醫(yī)科大學(xué)食品生命工學(xué)系及生物技術(shù)研究所，韓國(guó)抱川 11160）

青天葵，又名獨(dú)葉蓮、獨(dú)腳蓮、青蓮是蘭科植物毛唇芋蘭（Nervilia fordii(Hance) Schltr）的全草，主要分布于我國(guó)廣西、廣東、四川和云南等地[1]。青天葵也是一種具有較高藥用及食用價(jià)值的廣西特產(chǎn)藥材，具有抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和抑菌等功效，也常用于支氣管炎和肺炎等的臨床治療[2,3]。藥理研究表明，青天葵中主要藥效物質(zhì)為黃酮、多酚及三萜和甾體類等化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎和清除自由基等作用[4～8]，在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。目前，青天葵對(duì)腸道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以筆者前期研究的最佳工藝條件對(duì)青天葵進(jìn)行提取，在H2O2處理誘發(fā)Caco-2人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞氧化損傷模型上，研究青天葵甲醇提取物對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)并探討可能的機(jī)制。

腸道不僅是人體中重要的消化器官，其同時(shí)也在維持人體正常的生命活動(dòng)和抵御疾病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[9]。腸道屏障是人體常見(jiàn)的物理性防御結(jié)構(gòu)之一，其可以防止腸腔內(nèi)的有害細(xì)菌及細(xì)菌毒素通過(guò)侵入腸道黏膜組織進(jìn)入血液系統(tǒng)，阻止其對(duì)其他臟器的侵犯[10]。作為腸道屏障基本構(gòu)成單位的小腸上皮細(xì)胞在遭受于外部氧化應(yīng)激源刺激后會(huì)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，氧化應(yīng)激損傷也是引起腸道屏障功能喪失以及相關(guān)腸道疾病的重要致病原因之一[11]。作為一株在結(jié)構(gòu)和功能方面類似于人正常小腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，Caco-2人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞具有與正常小腸細(xì)胞類似的緊密連接和微絨毛等結(jié)構(gòu)以及其他相關(guān)酶系[12]。因此，Caco-2細(xì)胞被公認(rèn)為是用于研究腸上皮損傷修復(fù)機(jī)制的經(jīng)典細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青天葵購(gòu)買于廣西壯族自治區(qū)玉林市藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院廖月葵高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為廣西產(chǎn)青天葵Nervilia fordii(Hance) Schltr.全草，陰干備用；過(guò)氧化氫(H2O2)、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA)、青霉素-鏈霉素雙抗液、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；抗氧化物酶(SOD、CAT和GSH-Px)，乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞總蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；蘆丁(Rutin，批號(hào)：BZP0103)、沒(méi)食子酸(Gallic acid，批號(hào)：BZP0110)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

765S型紫外分光光度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；SHZ-亞型循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；EYELA N-1001S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化器械株式會(huì)社；TDL-80-2B低速臺(tái)式離心：上海安寧科學(xué)儀器廠；三洋 MCO-15AC二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱：日本三洋公司；Centrifuge 5418R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；ELx808酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Tek公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀：德國(guó)BMG公司；KQ5200DE型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器：東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司。

1.3 青天葵甲醇提取物的制備

選陰干的青天葵樣品，除雜粉碎后過(guò) 60目篩備用。室溫下，取10 g青天葵粉加入75%甲醇(200 mL)超聲提取60 min[9]。濾液經(jīng)3000 r/min離心15 min后棄渣收集上清，50 ℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，制備成青天葵甲醇提取物(收率為12.24%)，-20 ℃儲(chǔ)存待用。

1.4 青天葵甲醇提取物中總多酚、總黃酮含量的測(cè)定青天葵甲醇提取物中總多酚含量按

Folin-Ciocalteus法測(cè)定。0.1 mL樣品中加入10%的碳酸鈉溶液(2 mL)反應(yīng)5 min后，再加入福林酚試劑(0.1 mL)置避光處反應(yīng)30 min。測(cè)定反應(yīng)液在765 nm處的吸光度值。總酚含量以 GAE為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算并以mg GAE/g為單位?？傸S酮含量測(cè)定采用三氯化鋁比色法。取0.5 mL樣品與2 mL蒸餾水混合，加入10%氯化鋁溶液(0.15 mL)后測(cè)定420 nm處吸光度值?？傸S酮含量以 Rutin為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算并表示為 mg

Rutin/g。

1.5 青天葵甲醇提取物 DPPH 和羥基(OH)自由基清除能力測(cè)定

DPPH自由基清除率測(cè)定：將不同濃度的青天葵甲醇提取物樣品液(0.24 mg/mL～0.72 mg/mL)與DPPH標(biāo)準(zhǔn)液(150 μmol/L)各100 μL混勻后，室溫下避光反應(yīng)30 min后。在517 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。按照公式：[1-(OD樣品-OD樣品空白)/OD空白]×100%計(jì)算清除率(%)。

羥基自由基清除率測(cè)定：取200 μL不同濃度的青天葵甲醇提取物樣品液(濃度同 DPPH清除實(shí)驗(yàn)中所述)放入玻璃試管中，隨后加入6 mmol/L脫氧核糖，3 mmol/L過(guò)氧化氫，20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS) (pH 7.4)，400 μmol/L的氯化鐵溶液，400 μmol/L的EDTA-2Na溶液和400 μmol/L的抗壞血酸溶液各200 μL。在37 ℃條件下恒溫水浴1 h后，加入1 mL混合反應(yīng)液(含1%TBA溶液和2.8%TCA溶液)并在90 ℃條件下反應(yīng)30 min。使用765S紫外分光光度計(jì)測(cè)定532 nm處吸光度值。按照公式：[1-(OD樣品-OD樣品空白)/OD空白]×100%計(jì)算清除率(%)。

1.6 青天葵甲醇提取物對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)效果研究

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人結(jié)腸癌細(xì)胞株 Caco-2系由桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院鄒先瓊研究員饋贈(zèng)。細(xì)胞用含10% FBS與1%青-鏈霉素雙抗液的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液置于37 ℃、5%CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)，2～3d換液一次。細(xì)胞分別接種于 96 孔(1×104個(gè)/孔)和 6 孔(2×105個(gè)/孔)細(xì)胞培養(yǎng)板后，以DMEM培養(yǎng)液(含250 μmol/L H2O2)繼續(xù)培養(yǎng)4 h制備氧化損傷細(xì)胞模型。氧化損傷模型細(xì)胞以不同質(zhì)量濃度的青天葵甲醇提取物(10、50、100、200 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正常組為未經(jīng)過(guò)任何處理的正常Caco-2細(xì)胞。

1.6.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

Caco-2細(xì)胞先按前述分組處理并進(jìn)行24 h連續(xù)培養(yǎng)后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基并加入終質(zhì)量濃度為 0.5 mg/mL的MTT溶液(100 μL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，每孔加入 DMSO(100 μL)避光振蕩 30 min，測(cè)定OD490nm后按公式：細(xì)胞生存率(%)＝OD樣品組/OD正常組×100來(lái)計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.6.3 細(xì)胞內(nèi)MDA生成量的測(cè)定

所有細(xì)胞依前述分組處理后用冷PBS沖洗3次，細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞后，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解。細(xì)胞裂解液(500 μL)與400 μL的TBARS反應(yīng)液(含15%的TCA與0.67%TBA混合液)充分混勻后在95 ℃水浴中保溫20 min。冷卻后，加入3 mL的異丙醇提取色素并測(cè)定OD532nm，蛋白質(zhì)試劑盒定量細(xì)胞總蛋白量。按照公式 MDA 生成量/(μmol/mg protein)=[MDA含量(μmol/mL)×1.5 mL]/總蛋白質(zhì)含量(mg)計(jì)算MDA生成量。

1.6.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定

細(xì)胞依前述分組處理后，棄去培養(yǎng)液并加入含DCFH-DA(20 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃條件下孵育20 min，PBS沖洗細(xì)胞2次后收集細(xì)胞。在激發(fā)波長(zhǎng)為 485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 530 nm的條件下用FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，按照公式：相對(duì) ROS 水平/%=熒光強(qiáng)度樣品處理組/熒光強(qiáng)度正常組×100進(jìn)行計(jì)算。

1.6.5 細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶(SOD、CAT和GSH-Px)活力的測(cè)定

取適量經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞裂解液按照SOD、CAT和GSH-Px測(cè)定試劑盒說(shuō)明書步驟操作。Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白。細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶活力用細(xì)胞內(nèi)總蛋白量校正并以酶比活力單位(U/mg pro)表示。

1.6.6 細(xì)胞中IL-1β與IL-8炎性細(xì)胞因子分泌水平的測(cè)定

細(xì)胞接種到培養(yǎng)板并依前述方法處理后，4 ℃下收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。取適量培養(yǎng)上清液按照 IL-1β與 IL-8測(cè)定試劑盒說(shuō)明書步驟操作并用細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量作校正。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本研究中，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3次，結(jié)果以均值(means)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析與統(tǒng)計(jì)處理，p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 青天葵甲醇提取物的總多酚和總黃酮含量

如表1所示，青天葵甲醇提取物含有一定量的總黃酮(4.72±0.13 mg/g)和總多酚(4.25±0.46 mg/g)。其總黃酮和總多酚含量均高于許海棠等的研究結(jié)果[11]。

表1 青天葵甲醇提取物中總多酚和總黃酮含量Table 1 Total polyphones and total flavonoids in Nervilia fordii methanol extracts

2.2 青天葵甲醇提取物對(duì)體外自由基清除能力

圖1 青天葵甲醇提取物對(duì)DPPH和·OH自由基的半清除劑量IC50Fig.1 Semi-clearing doses of DPPH and ·OH radicals from the methanol extract of Nervilia fordii

如圖1示，青天葵甲醇提取物具有一定的體外清除自由基能力。其中，青天葵甲醇提取物對(duì)DPPH自由基的 IC50(0.117±0.05 mg/mL)弱于標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑BHA(0.084±0.03 mg/mL)。 而 對(duì) ·OH 自 由 基 的IC50(0.513±0.06 mg/mL)也較 BHA(0.260±0.05 mg/mL)弱。

2.3 青天葵甲醇提取物的對(duì)H2O2所致Caco-2細(xì)胞生存率和細(xì)胞LDH釋放水平的影響

不同濃度的青天葵甲醇提取物(10 μg/mL～200 μg/mL)與Caco-2細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后，處理組細(xì)胞的生存率均≥95%(結(jié)果未顯示)。

結(jié)果提示，青天葵甲醇提取物對(duì)正常培養(yǎng)狀態(tài)下的 Caco-2細(xì)胞不造成明顯的生長(zhǎng)抑制或細(xì)胞毒性作用。因此，10 μg/mL～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)的青天葵甲醇提取物可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Caco-2細(xì)胞經(jīng)H2O2(250 μmol/L)直接處理4 h后，其細(xì)胞生存率顯著下降(p＜0.05)。而受損細(xì)胞經(jīng) 10 μg/mL～200 μg/mL 濃度的青天葵甲醇提取物處理24 h后，細(xì)胞生存率較未經(jīng)青天葵提取物處理過(guò)的模型組細(xì)胞顯著提高(表2)，并呈現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。同時(shí)，H2O2處理也顯著造成Caco-2細(xì)胞內(nèi)的LDH大量釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中。模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中的 LDH水平與正常組細(xì)胞相比顯著升高，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。而青天葵甲醇提取物處理能抑制受損 Caco-2細(xì)胞的LDH溢出，且溢出抑制效果存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。

表2 青天葵甲醇提取物對(duì)H2O2所致Caco-2細(xì)胞生存率和細(xì)胞LDH釋放水平的影響Table 2 Effects of methanol extracts of Nervilia fordii on the survival rate and release of LDH from cells induced by H2O2

2.4 青天葵甲醇提取物對(duì)H2O2所致Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量的影響

如表3示，經(jīng)H2O2(250 μmol/L)處理4 h后能顯著造成正常Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高(p＜0.05)。經(jīng)不同濃度青天葵甲醇提取物(10、50、100和200 μg/mL)處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯下降。經(jīng)最高濃度200 μg/mL的青天葵提取物處理后，受損 Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平為最低。

250 μmol/L的H2O2的處理同時(shí)也能造成Caco-2細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著升高(p＜0.05)。青天葵甲醇提取物(10、50、100和200 μg/mL)處理能明顯抑制受損細(xì)胞內(nèi)氧化損傷標(biāo)記物MDA的生成(p＜0.05)。上述結(jié)果提示，青天葵甲醇提取物可以有效抑制氧化損傷細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成。SOD活力/(U/mg pro) GSH-Px活力/(U/mg pro)25.64±1.68 12.35±0.23 7.45±0.61* 3.29±0.49*9.97±0.38*#5.67±0.76*#13.48±0.64*#6.44±0.87*#16.87±0.43*#8.06±0.45*#18.49±0.33*#9.23±0.93*#

表3 青天葵甲醇提取物對(duì)H2O2所致Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量的影響Table 3 Effects of methanol extracts of Nervilia fordii on ROS and MDA contents in Caco-2 cells induced by H2O2

表4 青天葵甲醇提取物對(duì)H2O2所致Caco-2氧化損傷細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD和GSH-px酶活力的影響Table 4 Effects of methanol extracts of Nervilia fordii on CAT, SOD, and GSH-px activities in Caco-2 induced by H2O2

2.5 青天葵甲醇提取物對(duì)H2O2所致Caco-2氧化損傷細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px酶活力的影響

H2O2處理后引發(fā)的氧化損傷細(xì)胞中 SOD，CAT和GSH-Px等內(nèi)源性抗氧化物的酶活性較正常組顯著降低(表4)。而經(jīng)不同濃度青天葵甲醇提取物(10、50、100和200 μg/mL)處理24 h后，受損Caco-2細(xì)胞總SOD，CAT和GSH-Px等酶活性逐漸增高，且與未經(jīng)青天葵甲醇提取物處理過(guò)的損傷模型組相比具有顯著性差異(p＜0.05)。

2.6 青天葵甲醇提取物對(duì)H2O2所致Caco-2氧化損傷細(xì)胞內(nèi)IL-8和IL-10分泌水平的影響

依圖2示，經(jīng)濃度為250 μmol/L的H2O2處理4 h后能明顯造成Caco-2細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子IL-8分泌量的增加(p＜0.05)。經(jīng)ELSIA法檢測(cè)不同濃度青天葵甲醇提取物(10、50、100和200 μg/mL)處理后的Caco-2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，受損細(xì)胞中炎癥因子IL-8而分泌被顯著抑制(p＜0.05)。檢測(cè)受損細(xì)胞中抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌量時(shí)發(fā)現(xiàn)，青天葵甲醇提取物處理能夠提高受損Caco-2細(xì)胞中IL-10的分泌量。以上結(jié)果提示，青天葵甲醇提取物具有一定的抗炎效果。

圖2 青天葵甲醇提取物對(duì)H2O2處理的Caco-2細(xì)胞內(nèi)IL-8和IL-10分泌水平的影響Fig.2 Effect of methanol extracts of Nervilia fordii on secretion of IL-8 and IL-10 inCaco-2 cells treated with H2O2

3 結(jié)論

3.1 外源性刺激及感染等所造成的腸道細(xì)胞或組織中發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致結(jié)腸潰瘍、結(jié)腸癌等慢性腸道疾病產(chǎn)生的重要病理機(jī)制之一[12]。過(guò)度的氧化應(yīng)激會(huì)造成腸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)所含脂質(zhì)、代謝酶類、功能蛋白等物質(zhì)的變性失活從而引發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[13]。在正常生理狀態(tài)下，有機(jī)生命體由于進(jìn)行有氧呼吸和相關(guān)物質(zhì)代謝會(huì)產(chǎn)生一定量的活性氧與自由基。而細(xì)胞內(nèi)源性的抗氧化物系統(tǒng)，如SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化物酶及非酶性的谷胱甘肽均參與對(duì)活性氧和自由基的清除過(guò)程以保持體內(nèi)的氧化-還原平衡穩(wěn)態(tài)。但在某些病理狀態(tài)條件下，多余不能被清除的活性氧和自由基會(huì)成為引發(fā)氧化應(yīng)激損傷的始動(dòng)者。

3.2 當(dāng)細(xì)胞遭受強(qiáng)應(yīng)激后發(fā)生細(xì)胞損傷時(shí)，LDH會(huì)因細(xì)胞膜破裂而被釋放到細(xì)胞外部。因此，LDH被認(rèn)為是一種衡量細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激損傷的指標(biāo)物[14]。在本研究中，受損的Caco-2細(xì)胞在經(jīng)青天葵甲醇提取物處理后，其細(xì)胞生存率明顯得到提升。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)部的LDH酶漏出水平也得到抑制。該結(jié)果提示，青天葵甲醇提取物能很好地抑制氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞所造成的傷害。另一方面，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA同樣也是衡量細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度的重要指標(biāo)。細(xì)胞內(nèi)部過(guò)度蓄積的ROS會(huì)直接導(dǎo)致DNA斷裂，并造成對(duì)正常的細(xì)胞周期不同程度的影響。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi) ROS水平超過(guò)正常范圍時(shí)也能直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，甚至直接造成細(xì)胞死亡[15]。經(jīng)不同濃度的青天葵甲醇提取物處理之后，受損Caco-2細(xì)胞中ROS水平及反映細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化程度的指標(biāo)物MDA水平均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。這些結(jié)果同時(shí)提示，青天葵甲醇提取物可對(duì)H2O2誘發(fā)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有一定的抑制作用。

3.3 青天葵甲醇提取物還能顯著提高受損 Caco-2細(xì)胞中SOD、CAT和GSH-Px的活性。這些屬于內(nèi)源性抗氧化物酶的SOD、CAT和GSH-Px在機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的過(guò)程中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[16]。SOD通過(guò)直接清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基，阻斷其攻擊細(xì)胞膜上多價(jià)不飽和脂肪酸后所造成的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并有助于抑制具有細(xì)胞毒作用的MDA和4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal，HNE)的生成[17]。而 GSH-Px 則通過(guò)催化谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸凸入赘孰?，將有毒的過(guò)氧化物還原成羥基化合物，并近一步與CAT作用將 H2O2分解為水[18]。這些結(jié)果提示青天葵甲醇提取物具有增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源抗氧化系統(tǒng)活性，有助于維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)保證細(xì)胞正常生理功能免受氧化應(yīng)激的干擾。

3.4 此外，青天葵甲醇提取物對(duì)氧化損傷 Caco-2細(xì)胞中的炎性和抗炎性細(xì)胞因子的分泌具有一定的調(diào)控作用。能抑制受損 Caco-2細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子 IL-8的過(guò)度分泌，并提高抗炎性因子IL-10的分泌量。抑制IL-8的分泌，對(duì)于與炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的腸道疾病有一定的緩解和控制作用[19]。屬于 Th2型細(xì)胞因子的IL-10與其配體IL-10R相結(jié)合參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞，B細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分化與增值，從而調(diào)控免疫反應(yīng)以及抗感染等生理活動(dòng)[21]。IL-10可以抑制所有的促炎性因子的合成和釋放，因此其在緩解腸道免疫疾病方面具有極其重要的作用[20～22]。

3.5 本研究以 H2O2作為體外氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)劑建立人小腸上皮 Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型來(lái)研究青天葵甲醇提取物對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。研究結(jié)果提示，青天葵甲醇提取物能夠通過(guò)提升受損細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化物(SOD、CAT和GSH-Px)等酶的活力來(lái)抑制氧化應(yīng)激損傷所引發(fā)的細(xì)胞ROS水平的升高，同時(shí)抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物MDA的生成。此外，青天葵甲醇提取物還能調(diào)控炎性細(xì)胞因子 IL-8與抗炎性因子IL-10的分泌平衡來(lái)緩解氧化應(yīng)激所引進(jìn)的腸道上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。而青天葵提取物的體外抗氧化能力及對(duì)氧化受損細(xì)胞的保護(hù)作用可能源于其所含有的多酚和黃酮類物質(zhì)。因此，后續(xù)研究應(yīng)集中從分子層面來(lái)探究青天葵提取物中的黃酮、多酚組分對(duì)氧化損傷應(yīng)激過(guò)程中特定信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。