紫檀芪對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血脂的改善及對(duì)PPARγ的調(diào)控作用

劉欣欣，孫華磊，葛惠娜，王騰，李文杰

（鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，河南鄭州 450001）

Ⅱ型糖尿病（type Ⅱ diabetes mellitus，T2DM）是由胰島素分泌障礙或胰島素抵抗導(dǎo)致的糖代謝紊亂的疾病，常伴有脂代謝異常，主要表現(xiàn)為甘油三酯(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholestelipoprotein-cholesterol，LDL-C)的升高，是糖尿病易發(fā)心血管疾病的主要原因[1,2]。目前，Ⅱ型糖尿病的治療方法有口服降血糖藥物和注射胰島素，但這些治療方式對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一些副作用，如高劑量胰島素或降糖藥可能引起低血糖、腹瀉和肝臟損傷等。因此，尋找天然、毒副作用較小的抗Ⅱ型糖尿病防治方法，逐漸成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的重要課題。

紫檀芪（Pterostilbene，PTE）是紫檀中所含的一種化學(xué)成分，是一種天然多酚化合物，主要存在于藍(lán)莓、葡萄和越橘果中。來(lái)源于天然植物的紫檀芪低毒或幾乎無(wú)毒，在糖尿病治療中具有良好的應(yīng)用前景[3]。近年來(lái)的研究表明，紫檀芪能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，且具有抗氧化、降血脂和降血糖等作用[4～7]。Rimando等[8]人發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，高膽固醇倉(cāng)鼠口服紫檀芪可以使血糖水平降低14%，血漿低密度脂蛋白降低29%，高密度脂蛋白增加7%。此外，在脂肪細(xì)胞中，紫檀芪可以降低細(xì)胞增殖、脂質(zhì)積聚和三?；视偷男罘e[9]。然而，紫檀芪改善Ⅱ型糖尿病脂代謝紊亂的機(jī)制尚未完全清楚，有待進(jìn)一步研究。

本研究旨在通過(guò)高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈霉菌素（streptozotocin，STZ）注射構(gòu)建Ⅱ型糖尿病大鼠，采用紫檀芪干預(yù)，觀(guān)察紫檀芪對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血脂的影響，檢測(cè)紫檀芪對(duì)大鼠血清氧化應(yīng)激水平的作用以及對(duì)大鼠脂肪組織中PPARγmRNA和蛋白的影響，初步探討紫檀芪對(duì)脂代謝紊亂作用發(fā)生的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鏈脲佐菌素，美國(guó)Sigma公司；紫檀芪，上海士豐生物有限公司；甘油三酯測(cè)定試劑盒，中生北控生物科技有限公司；總膽固醇測(cè)定試劑盒，中生北控生物科技有限公司；高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒，中生北控生物科技有限公司；低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒，中生北控生物科技有限公司；脂肪組織蛋白提取試劑盒，上海貝博生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；PPARγ多克隆抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；卓越360全自動(dòng)生化分析儀，上海科華生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

選取SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。室溫為18～23 ℃，相對(duì)濕度為 45～55%，通風(fēng)良好，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，晝夜間隔12 h。

普通飼料由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，高脂高糖飼料：59.5%普通粉狀飼料、20%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 2型糖尿病大鼠模型的建立[10,11]及實(shí)驗(yàn)分組

100只4周齡雄性SD大鼠，體重170～220 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠給予高脂高糖飼料。4周后夜間禁食12 h，按40 mg/kg劑量一次性空腹注射鏈脲佐菌素STZ溶液，制備Ⅱ型糖尿病大鼠模型。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射相等體積的檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ后，尾靜脈采血檢測(cè)大鼠空腹血糖，若空腹血糖≥11.1 mmol/L，并且出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，一周后大鼠血糖穩(wěn)定未恢復(fù)正常即為造模成功。按上述成膜標(biāo)準(zhǔn)篩選出75只大鼠，造模成功率為83.3%。隨機(jī)選取造模成功的大鼠分為Ⅱ型糖尿病模型組、紫檀芪低劑量干預(yù)組（20 mg/kg）、紫檀芪中劑量干預(yù)組（40 mg/kg）、紫檀芪高劑量干預(yù)組（80 mg/kg），各10只，于每日固定時(shí)間按照體重計(jì)算灌胃劑量進(jìn)行灌胃一次。正常對(duì)照組和Ⅱ型糖尿病組于每日固定時(shí)間給予羧甲基纖維素鈉溶液灌胃一次。連續(xù)干預(yù)7周后，稱(chēng)體重，并記錄大鼠尿量、攝食量和飲水量；然后水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，測(cè)定血脂各項(xiàng)指標(biāo)及血清中氧化應(yīng)激水平的變化；分離脂肪組織，檢測(cè)脂肪組織中PPARγ蛋白的表達(dá)量。

1.3.2 血脂的測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholestelipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C），檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明，TG、TC測(cè)定采用一點(diǎn)終點(diǎn)法，LDL-C測(cè)定采用兩點(diǎn)重點(diǎn)法，HDL-C測(cè)定采用過(guò)氧化氫酶清除法。

1.3.3 血清中氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)

取出待測(cè)血清，采用WST-1法檢測(cè)SOD活性，硫代巴比妥酸染色（TBA）法檢測(cè)MDA含量，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明。

1.3.4 熒光定量 PCR檢測(cè)大鼠脂肪組織PPARγmRNA的水平

提取脂肪組織的總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄 mRNA為cDNA。根據(jù)Genebank中的PPARγ基因和內(nèi)參基因β-actin的基因組DNA序列，應(yīng)用Premier Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PPARγ基因引物系列：上游GAAGAGGCCACATGAAGAGC，下游CCTTGCATCCTTCACAAGCA；β-actin基因引物序列：上游 GTGGGGCGCCCCAGGCACCA，下游CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC。使用熒光定量PCR進(jìn)行反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95 ℃，5 min，95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，40 s，擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量計(jì)算方法對(duì)目的基因PPARγmRNA進(jìn)行熒光定量。

1.3.5 western blot測(cè)定大鼠脂肪組織中PPARγ蛋白的表達(dá)

取各組大鼠脂肪組織采用BAC法測(cè)定蛋白濃度，以β-actin作為內(nèi)參，并按照western blot程序進(jìn)行操作[12]。ECL顯色、曝光。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均值比較采用單因素方差分析，組間兩兩數(shù)值比較用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立

由表1所示，造模后，Ⅱ型糖尿病組大鼠血糖顯著高于正常對(duì)照組（p＜0.05）。與正常對(duì)照組相比，Ⅱ型糖尿病組大鼠體重變化不明顯，但飲食量、飲水量和尿量增高（p＜0.05）。結(jié)果說(shuō)明，本研究中2型糖尿病大鼠造模成功。

STZ具有選擇性損傷胰島β細(xì)胞的功能，對(duì)動(dòng)物的其他組織無(wú)明顯的損傷作用，是較常用的化學(xué)誘導(dǎo)糖尿病試劑，但不同劑量的STZ會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞不同程度的損傷，較大劑量的STZ會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物胰島β細(xì)胞壞死[13]，且較好的動(dòng)物模型需要考慮膳食因素。因此，目前國(guó)內(nèi)研究用于構(gòu)建Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥常用的方法是膳食加藥物誘導(dǎo)[14]。有研究表明，高脂飼料喂養(yǎng)4周后，注射STZ劑量為30 mg/kg和60 mg/kg后，造模成功率分別為80%和25%[15]。本實(shí)驗(yàn)采用4周齡，雄性SD大鼠作為研究對(duì)象，采用隨機(jī)分組方式，分為正常對(duì)照組和Ⅱ型糖尿病造模組，正常對(duì)照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，Ⅱ型糖尿病造模大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)。4周后，Ⅱ型糖尿病造模大鼠腹腔注射 STZ（40 mg/kg）溶液，注射 STZ后，大鼠FBG≥11.1 mmol/L并伴有多飲、多食、多尿癥狀，一周后大鼠血糖穩(wěn)定未恢復(fù)正常即為造模成功，造模成功率為83.3%。

表1 注射STZ1周后大鼠空腹血糖、體重、飲食量、飲水量和尿量Table 1 Fasting blood glucose, body weight, food and water consumption, urinal quantity in rats after STZ injection(±s)

表1 注射STZ1周后大鼠空腹血糖、體重、飲食量、飲水量和尿量Table 1 Fasting blood glucose, body weight, food and water consumption, urinal quantity in rats after STZ injection(±s)

注：*.與正常對(duì)照組相比，p＜0.05。

組別 n 血糖/(mmol/L) 體重/g 飲食量/g 飲水量/g 尿量/mL正常對(duì)照組 10 5.52±1.20 268.80±30.97 18.51±3.14 28.20±15.24 17.77±3.67Ⅱ型糖尿病組 75 23.76±4.62* 273.35±39.67 29.69±5.06* 144.38±25.13* 122.70±28.86*

2.2 紫檀芪對(duì)各組大鼠血糖、體重、攝食量、飲水量和尿量的影響（±s）

表2顯示，干預(yù)7周后，Ⅱ型糖尿病組大鼠體重低于正常對(duì)照組，血糖、飲食量、飲水量和尿量高于正常對(duì)照組。說(shuō)明，Ⅱ型糖尿病組大鼠的高血糖水平、多飲、多食、多尿、體重減輕的癥狀仍然存在。紫檀芪干預(yù)組大鼠的體重和飲水量與Ⅱ型糖尿病組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。紫檀芪低劑量和中劑量組大鼠的血糖低于Ⅱ型糖尿?。╬＜0.05）；紫檀芪低劑量組大鼠的飲食量低于Ⅱ型糖尿?。╬＜0.05）；與Ⅱ型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠的尿量下降（p＜0.05），說(shuō)明紫檀芪可以改善Ⅱ型糖尿病的癥狀，降低Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖、飲食量和尿量。

表2 紫檀芪對(duì)各組大鼠體重、飲食量、飲水量和尿量的影響Table 2 Body weight, food and water consumption, urinal quantity in rats after PTE intervention(±s)

表2 紫檀芪對(duì)各組大鼠體重、飲食量、飲水量和尿量的影響Table 2 Body weight, food and water consumption, urinal quantity in rats after PTE intervention(±s)

注：*.與正常對(duì)照組相比，p＜0.05；#.與Ⅱ型糖尿病相比，p＜0.05。

組別 n 血糖/(mmol/L) 體重/g 飲食量/g正常對(duì)照組 10 8.13±1.92# 496.13±18.04# 20.32±3.40# 30.51±7.96# 12.86±2.69#飲水量/g 尿量/mL 2 型糖尿病組 10 30.12±3.62* 338.42±34.26* 39.07±4.28* 205.14±26.14* 165.13±24.74*紫檀芪低劑量組 10 25.09±6.68*# 357.03±15.84* 26.87±4.62*# 211.76±38.83* 124.82±33.22*#紫檀芪中劑量組 10 25.20±4.48*# 326.71±30.63* 33.15±4.09*# 186.23±28.82* 112.64±25.11*#紫檀芪高劑量組 10 28.21±4.40* 342.78±27.04* 35.46±4.72* 184.86±34.14* 122.36±32.80*#

2.3 紫檀芪對(duì)各組大鼠血脂的影響

表3所示：干預(yù)7周后，與正常對(duì)照組相比，Ⅱ型糖尿病組大鼠TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。與Ⅱ型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組TG水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）；紫檀芪低劑量組和中劑量組大鼠TC和LDL-C水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。紫檀芪低劑量、中劑量和高劑量組HDL-C水平與Ⅱ型糖尿病組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

近年來(lái)，脂代謝紊亂在Ⅱ型糖尿病發(fā)生發(fā)展中逐漸引起重視。脂質(zhì)在肌肉組織中積聚會(huì)引起胰島素抵抗，在胰腺組織中積聚可以損傷胰島β細(xì)胞，影響胰島素分泌功能。Ⅱ型糖尿病由于胰島素受體發(fā)生缺陷，胰島素靶細(xì)胞發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，葡萄糖利用障礙，脂質(zhì)分解作用降低，使得血糖和TG、TC、LDL-C水平升高，產(chǎn)生糖代謝和脂代謝紊亂，導(dǎo)致機(jī)體多功能損傷[16,17]。本研究結(jié)果顯示，Ⅱ型糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯的脂代謝紊亂，即TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低。紫檀芪干預(yù)后，脂代謝紊亂減輕，TG、TC、LDL-C水平較Ⅱ型糖尿病組大鼠降低。說(shuō)明紫檀芪可以改善Ⅱ型糖尿病的脂代謝紊亂。

表3 紫檀芪對(duì)各組大鼠血脂水平的影響Table 3 Blood lipid in rats after PTE intervention(±s)

注：*.與正常對(duì)照組相比，p＜0.05；#.與Ⅱ型糖尿病相比，p＜0.05。

組別 n TG/(mmol/L) TC/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L) HDL-C/(mmol/L)正常對(duì)照組 10 0.68±0.47# 1.71±0.48# 0.31±0.14# 1.02±0.17#Ⅱ型糖尿病組 10 5.12±0.89* 2.96±0.69* 0.96±0.20* 0.51±0.10*紫檀芪低劑量組 10 2.53±0.98*# 1.95±0.63# 0.28±0.12# 0.55±0.11*紫檀芪中劑量組 10 3.76±0.92*# 2.13±0.87# 0.75±0.14*# 0.41±0.12*紫檀芪高劑量組 10 3.54±0.94*# 2.51±0.80* 0.88±0.25* 0.59±0.11*

2.4 紫檀芪對(duì)各組大鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響

表4結(jié)果所示：與正常對(duì)照組相比，Ⅱ型糖尿病組大鼠血清中SOD活性降低，MDA水平升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。與Ⅱ型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量組和中劑量組大鼠血清中 SOD活性升高，MDA水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。

氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）是指機(jī)體氧化和抗氧化作用失衡，組織細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多，超過(guò)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)其的清除能力，從而導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞損傷，造成細(xì)胞功能障礙或死亡。研究表明，Ⅱ型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展與氧化應(yīng)激有密切的關(guān)系[18]。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，降低胰島素與受體的結(jié)合率，阻斷胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起胰島素抵抗[19]。SOD作為抗氧化酶，能夠清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，抑制并修復(fù)氧自由基對(duì)機(jī)體細(xì)胞造成的傷害，可以間接反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力。MDA是降解的過(guò)氧化脂質(zhì)的產(chǎn)物，可以間接反映機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激的程度及氧自由基對(duì)機(jī)體細(xì)胞損害的程度，在機(jī)體內(nèi)的水平與 SOD呈負(fù)相關(guān)。本研究說(shuō)明紫檀芪具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能夠改善Ⅱ型糖尿病血清氧化應(yīng)激水平，提高SOD活性。

表4 紫檀芪對(duì)各組大鼠血清中SOD和MDA的影響Table 4 The activity of SOD and level of MDA in blood after PTE intervention(±s)

表4 紫檀芪對(duì)各組大鼠血清中SOD和MDA的影響Table 4 The activity of SOD and level of MDA in blood after PTE intervention(±s)

注：*.與正常對(duì)照組相比，p＜0.05；#.與Ⅱ型糖尿病相比，p＜0.05。

組別 n SOD/(U/mL) MDA/(nmol/mgprot)正常對(duì)照組 10 127.76±8.66# 8.41±1.46#2型糖尿病組 10 92.67±7.31* 17.68±3.90*紫檀芪低劑量組 10 118.63±10.85*# 9.72±2.04*#紫檀芪中劑量組 10 100.84±3.43*# 13.88±2.31*#紫檀芪高劑量組 10 95.84±7.45* 15.73±2.38*

2.5 紫檀芪對(duì)各組大鼠脂肪組織中 PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)的影響

熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示（見(jiàn)表5和圖1），與正常對(duì)照組相比，Ⅱ型糖尿病大鼠脂肪組織中PPARγmRNA和蛋白表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。與Ⅱ型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠脂肪組織中PPARγmRNA 和蛋白表達(dá)量增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。

脂肪組織是胰島素作用的重要靶點(diǎn)和糖脂代謝主要場(chǎng)所，一旦脂肪細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗，將嚴(yán)重影響周?chē)M織的糖脂代謝；此外，脂肪組織可以分泌多種脂肪因子即蛋白因子，通過(guò)自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌的途徑參與多種復(fù)雜的代謝途徑[20]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是一類(lèi)由配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，PPAR可分為PPARα、β/δ和γ三種類(lèi)型。其中PPARγ主要在脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞及肌肉細(xì)胞中表達(dá)，在脂肪細(xì)胞分化、脂類(lèi)代謝及胰島素抵抗中扮演重要角色[21,22]。本研究結(jié)果顯示，Ⅱ型糖尿病組脂肪組織中PPARγ表達(dá)較正常對(duì)照組低，干預(yù)紫檀芪后PPARγ表達(dá)顯著增高，提示紫檀芪改善Ⅱ型糖尿病脂代謝紊亂可能通過(guò)上調(diào) PPARγ表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。然而紫檀芪對(duì)Ⅱ型糖尿病的改善可能存在多靶點(diǎn)、多部位、多途徑，有待進(jìn)一步探討。p＜0.05。

圖1 各組大鼠脂肪組織中PPARγ蛋白表達(dá)的比較Fig.1 Expression of PPARγ in fat tissue

表5 各組大鼠脂肪組織中PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 5 PPARγ mRNA in adipose tissue(±s)

表5 各組大鼠脂肪組織中PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 5 PPARγ mRNA in adipose tissue(±s)

注：*.與正常對(duì)照組相比，p＜0.05；#.與Ⅱ型糖尿病相比，

組別 n PPARγ mRNA正常對(duì)照組 10 1.65±0.27#2型糖尿病組 10 0.66±0.38*紫檀芪低劑量組 10 3.01±0.55*#紫檀芪中劑量組 10 3.86±0.64*#紫檀芪高劑量組 10 4.19±0.59*#

3 結(jié)論

目前，臨床使用胰島素增敏劑以噻唑烷二酮類(lèi)藥物（thiazolidinediones，TZDs）效果為佳，近年來(lái)許多研究確定 PPARγ是 TZDs作用的靶分子。但是，TZDs通過(guò)增加脂肪酸代謝和促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用的同時(shí)，導(dǎo)致脂肪積聚增多引起體重和體脂增加，并且有頭痛、水腫等不良反應(yīng)，最終，無(wú)法改善脂代謝紊亂癥狀。本研究證明紫檀芪可以改善2型糖尿病脂代謝紊亂以及調(diào)節(jié)血清氧化應(yīng)激水平，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PPARγ有關(guān)，這將為2型糖尿病的防治提供新思路，然而紫檀芪改善2型糖尿病脂代謝紊亂的具體分子機(jī)制有待深入研究。