TGFBR1基因調控Wnt/β-catenin信號通路對結締組織病相關的肺間質病變中抗纖維化的機制研究

岳彩芳 付冰冰 駱 鵬

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，佳木斯154002)

結締組織引起的間質性肺疾病稱為結締組織病相關性疾病(Connective tissue disease interstitial lung disease，CTD-ILD)，主要的病理過程為炎性細胞的彌漫性浸潤，肌成纖維細胞和成纖維細胞及一些細胞外的基質聚集在肺間質，并發(fā)生大量沉積，導致肺泡及毛細血管損傷，間質組織損傷和修復反復交替，最終引起肺結構發(fā)生重塑而導致肺的纖維化[1,2]。近些年來，雖然對該病的認識有一定的提高，但間質性肺病仍是難治的一類疾病，且無有效的治療方法[3]。結締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)、轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)等多種促進纖維化的因子在纖維變性過程中發(fā)揮作用，可增加成纖維細胞的增殖和分化，誘導其胞外機制合成增多，TGF-β1也被認為是在細胞和組織纖維化過程促纖維化最關鍵的細胞因子[4,5]。在人體的各個系統(tǒng)有TGF-βs超家族的分布，TGF-β受體Ⅰ(TGF-β receptor Ⅰ，TGFBR1)是TGF-β1/SMADs信號通路的一個重要環(huán)節(jié)，有研究發(fā)現(xiàn)，TGFBR1的敲除可阻斷TGF-β1/SMADs信號通路，同樣有抗纖維化的作用[6]。研究TGFBR1在肺纖維化中的作用及調控機制，將為CTD-ILD的治療開辟一條新思路。因此，本研究首先檢測TGFBR1在CTD-ILD肺組織的表達，用TGF-β1刺激MRC-5細胞，檢測抑制TGFBR1表達對細胞活力、Ⅰ型膠原、CTGF、α-平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-Cad)表達的影響，并研究可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器 胎牛血清購自美國Gibco；DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000轉染試劑盒均購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、CCK8試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；TGFBR1、Ⅰ型膠原、CTGF、E-Cad、α-SMA、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、c-Myc、GAPDH抗體均購自美國ABCam公司；酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.1.2CTD-ILD患者一般資料 收集2014年5月至2016年7月在佳木斯大學附屬第一醫(yī)院風濕免疫科就診的CTD-ILD行CT引導下細針穿刺肺活檢術或纖維支氣管活檢術患者，共40例，其中男性10例，女性30例，平均年齡(46.83±2.02)歲，所有患者符合CTD-ILD的納入標準，排除因遺傳、藥物、腫瘤、吸煙等因素引起的肺動脈高壓、肺間質病變、慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病。另選取不吸煙且無感染的肺癌患者的正常癌旁組織作為正常對照組，共25例，其中男性8例，女性17例。對照組與實驗組的性別及年齡差異無統(tǒng)計學意義。所有樣本的采集均得到患者的知情同意，本研究獲當?shù)貍惱砦瘑T會的批準。

1.2方法

1.2.1細胞及其培養(yǎng) 人胚肺成纖維細胞系MRC-5購自上海；細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及100 U/ml的青霉素和100 U/ml的鏈霉素)中培養(yǎng)，細胞生長為貼壁，2 d傳代一次。

1.2.2實驗分組 細胞分為空白對照組、TGF-β1組(2 μg/L的TGF-β1刺激細胞)、陰性對照組(NC組，2 μg/L的TGF-β1刺激細胞48 h+轉染無干擾作用的siRNA)、TGFBR1-siRNA組(2 μg/L的TGF-β1刺激細胞48 h+轉染干擾TGFBR1表達的siRNA)。轉染前將MRC-5細胞用含血清DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，細胞生長達80%以上融合時，不含胎牛血清培養(yǎng)基靜止細胞24 h，使同步化。轉染參照LipofectamineTM2000說明書，轉染后置于培養(yǎng)箱內正常培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗研究。

1.2.3Western blot 提取4組細胞中的蛋白，BCA法測定蛋白濃度，40 μg/孔蛋白樣品行10%的SDS-PAGE分離，PVDF轉膜、5%的脫脂奶粉封閉后，4℃孵育皆按照1∶1 000稀釋TGFBR1、Ⅰ型膠原、CTGF、α-SMA、E-cad、β-catenin、c-Myc、GAPDH一抗過夜，洗膜，二抗孵育，室溫孵育1 h，洗膜。化學發(fā)光法顯色。實驗重復3次。

1.2.4細胞增殖實驗 通過CCK8法檢測細胞活力。于每孔細胞中加入CCK8試劑10 μl，37℃條件下孵育4 h。空白對照孔調零，酶標儀檢測在490 nm 波長下的光密度值(OD)，以光密度值反映細胞的活力，間接反映出各組細胞增殖能力。實驗重復3次。

2 結果

2.1TGFBR1在CTD-ILD肺組織表達 TGFBR1在CTD-ILD肺組織及正常肺組織中均有表達，表達量分別為0.453±0.052、0.137±0.016，在CTD-ILD肺組織中的表達顯著高于正常肺組織(t=36.734，P=0.000)。見圖1。

2.2各組細胞中TGFBR1的蛋白表達 Western blot檢測TGF-β1刺激及TGFBR1的siRNA轉染后的MRC-5細胞中TGFBR1的蛋白表達，結果如圖2和表1所示，TGF-β1組TGFBR1的蛋白表達顯著高于空白對照組(t=9.076，P=0.000)，TGF-β1組和NC組間TGFBR1表達差異無統(tǒng)計學意義(t=1.147，P=0.285)，而TGFBR1-siRNA組TGFBR1的表達顯著低于TGF-β1組(t=6.512，P=0.000)。

2.3TGFBR1基因對MRC-5細胞活力的影響 通過CCK8法檢測各組細胞的活力，結果如表2所示，TGF-β1組OD值顯著高于空白對照組(t=8.638，P=0.000)，TGF-β1組和NC組間OD值差異無統(tǒng)計學意義(t=0.399，P=0.700)，而TGFBR1-siRNA組OD值顯著低于TGF-β1組(t=5.604，P=0.001)。

2.4TGFBR1基因對MRC-5細胞Ⅰ型膠原、CTGF、α-SMA、E-cad表達的影響 與空白對照組比較，TGF-β1組Ⅰ型膠原、CTGF、α-SMA蛋白表達均顯著升高，E-cad蛋白表達顯著降低(t1=7.522，P1=0.000；t2=10.210，P2=0.000；t3=12.809，P3=0.000；t4=9.709，P4=0.000)，TGF-β1組和NC組間Ⅰ型膠原、CTGF、α-SMA和E-cad的表達差異均無統(tǒng)計學意義(t1=1.120，P1=0.295；t2=0.394，P2=0.704；t3=0.646，P3=0.536；t4=0.663，P4=0.526)，而TGFBR1-siRNA組Ⅰ型膠原、CTGF、α-SMA表達均顯著低于TGF-β1組(t1=2.484，P1=0.038；t2=3.944，P2=0.004；t3=8.116，P3=0.000)，E-cad表達表達顯著高于TGF-β1組(t=4.689，P=0.002)。見圖3、表3。

圖1 TGFBR1在CTD-ILD肺組織表達(n=40)Fig.1 TGFBR1 expression in CTD-ILD lung tissue (n=40)

圖2 各組細胞中TGFBR1蛋白的表達Fig.2 Protein expression of TGFBR1 in cells of each group

表1各組細胞中TGFBR1的蛋白相對表達量(n=3)

Tab.1RelativeexpressionofTGFBR1proteinincellsofeachgroup(n=3)

GroupsRelative protein expression of TGFBR1Blank group0.113±0.013TGF-β1 group0.382±0.0451)NC group0.416±0.049TGFBR1-siRNA group0.189±0.0262)F49.304P0.000

Note：Compared with the blank group,1)P<0.05;compared with the TGF-β1 group,2)P<0.05.

2.5TGFBR1基因對MRC-5細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響 Western blot檢測TGFBR1基因對MRC-5細胞Wnt/β-catenin信號通路β-catenin、c-Myc的蛋白表達的影響，結果如圖4和表4所示，TGF-β1組β-catenin、c-Myc的蛋白表達均顯著高于空白對照組(t1=14.245，P1=0.000；t2=7.528，P2=0.000)，TGF-β1組和NC組β-catenin、c-Myc的蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(t1=0.463，P1=0.656；t2=1.783，P2=0.112)，而TGFBR1-siRNA組β-catenin、c-Myc的蛋白表達均顯著低于TGF-β1組(t1=10.809，P1=0.000；t2=4.557，P2=0.002)。

表2TGFBR1基因對MRC-5細胞活力的影響(n=3)

Tab.2EffectofTGFBR1geneonMRC-5cellviability(n=3)

GroupsOD490Blank group0.421±0.042TGF-β1 group0.962±0.0961)NC group0.937±0.094TGFBR1-siRNA group0.611±0.0612)F35.057P0.000

Note：Compared with the blank group, 1)P<0.05;compared with the TGF-β1 group,2)P<0.05.

圖3 TGFBR1基因對MRC-5細胞Ⅰ型膠原、CTGF、α-SMA、E-cad表達的影響Fig.3 Effect of TGFBR1 gene on expression of type Ⅰ collagen,CTGF,α-SMA and E-cad in MRC-5 cells

表3TGFBR1基因對MRC-5細胞Ⅰ型膠原、CTGF、α-SMA、E-cad表達的影響(n=3)

Tab.3EffectofTGFBR1geneonexpressionoftypeIcollagen,CTGF,α-SMAandE-cadinMRC-5cells(n=3)

GroupsRelative protein expressionCollagenⅠCTGFα-SMAE-cadBlank group0.111±0.0120.082±0.0090.118±0.0130.311±0.041TGF-β1 group0.326±0.0411)0.315±0.0381)0.653±0.0721)0.106±0.0121)NC group0.358±0.0490.306±0.0320.626±0.0670.120±0.015TGFBR1-siRNA group0.255±0.0262)0.225±0.0242)0.314±0.0252)0.205±0.0252)F29.50744.69076.02039.987P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the blank group, 1)P<0.05;compared with the TGF-β1 group,2)P<0.05.

圖4 TGFBR1基因對MRC-5細胞β-catenin、c-Myc表達的影響Fig.4 Effect of TGFBR1 gene on expression of β-catenin and c-Myc in MRC-5 cells

表4TGFBR1基因對MRC-5細胞β-catenin、c-Myc表達的影響(n=3)

Tab.4EffectofTGFBR1geneonexpressionofβ-cateninandc-MycinMRC-5cells(n=3)

GroupsRelative protein expressionβ-cateninc-MycBlank group0.068±0.0080.121±0.018TGF-β1 group0.437±0.0451)0.311±0.0371)NC group0.425±0.0410.356±0.040TGFBR1-siRNA group0.157±0.0162)0.196±0.0232)F104.79436.054P0.0000.000

Note：compared with the blank group,1)P<0.05;compared with the TGF-β1 group,2)P<0.05.

3 討論

CTD-ILD有較高的臨床發(fā)病率和死亡率，缺乏有效的治療方法，因此，間質性肺疾病受到人們的重視。肺成纖維細胞的增殖、活化、合成、分化及分泌細胞外基質是發(fā)生肺纖維化的中心事件，成纖維細胞增殖或凋亡不足是導致肺發(fā)生纖維化的重要環(huán)節(jié)，抑制肺成纖維細胞的增殖及誘導凋亡對于抗纖維化具有重要意義[7,8]。TGF-β1是一個重要的細胞因子，是目前發(fā)現(xiàn)的導致纖維化最重要的因子之一，有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能增強細胞外基質沉積，且還能抑制膠原的降解，在肺間質性纖維化患者和動物的纖維化模型中TGF-β1的表達量升高，TGF-β1的過表達可導致鼠的肺發(fā)生纖維化[9-11]。在CTD-ILD患者的肺組織也可檢測到TGF-β1的表達升高[12]。這說明TGF-β1在肺的纖維化中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能與TGFBR1結合，抑制多種細胞的增殖、分化及促進細胞間質形成[13,14]；肺纖維化過程中miR-181b的過表達可通過抑制靶蛋白TGFBR1表達，使TGF-β1信號阻斷，從而降低肺的纖維化程度[15]。TGFBR1對肺的纖維化影響及機制研究并不多。

RNA干擾(RNAi)又稱為基因沉默，是一種新的阻斷基因表達技術，具有高效性和特異性，目前在研究基因功能等方面得到廣泛的應用[16-18]。本研究首先檢測到TGFBR1在CTD-ILD患者的肺組織表達量升高，用TGF-β1刺激MRC-5細胞，并將TGFBR1的siRNA轉染細胞，以檢測TGFBR1在CTD-ILD的纖維化中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可促進肺成纖維細胞的增殖[19]，本研究也檢測到TGF-β1可增加細胞活力，與前人研究一致，而轉染TGFBR1的siRNA可降低細胞活力。Ⅰ型膠原是一種外分泌的膠原蛋白，由成纖維細胞合成并分泌到細胞外，參與構成細胞外成分，在肺纖維化中有重要作用[20,21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人胚肺成纖維細胞中可通過抑制Ⅰ型膠原表達降低矽肺的發(fā)生[22]。CTGF為TGF-β1下游的一個效應分子，在肺的纖維化發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，抑制CTGF表達可降低MRC-5細胞增殖、細胞外基質合成及表型轉化，可能是抗肺纖維化的一個靶點[23-25]。肺泡上皮-間充質轉化(EMT)是肺損傷的一個環(huán)節(jié)，在EMT過程中，E-Cad表達下調，α-SMA、波形蛋白等間質表型標志物表達上調[26]，因此，本研究選擇E-Cad和α-SMA評定TGFBR1誘導的EMT過程。研究結果顯示，轉染TGFBR1的siRNA可下調TGF-β1引起的Ⅰ型膠原、CTGF、α-SMA表達升高，上調E-Cad表達。多種信號通路參與肺的纖維化發(fā)生，如TGF-β1/Smad3、細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、Wnt等信號通路[27,28]，Wnt/β-catenin信號通路是一條經典的Wnt信號通路，由Wnt蛋白、核內轉錄因子、跨膜受體胞質蛋白和下游的靶基因組成，與多種疾病的發(fā)生有關。研究顯示，抑制Wnt/β-catenin信號通路可降低肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[29,30]。本研究結果顯示，轉染TGFBR1的siRNA可降低Wnt/β-catenin信號通路β-catenin、c-Myc表達。

綜上所述，GFBR1基因在CTD-ILD肺組織中表達升高，抑制TGFBR1的表達可通過下調Wnt/β-catenin信號通路降低肺成纖維細胞活力，下調Ⅰ型膠原、CTGF、α-SMA表達和上調E-Cad表達而達到肺的抗纖維化作用。本研究提示GFBR1可能是反映纖維化的一個指標，可能成為CTD-ILD治療的分子靶點。但還需更多的理論及臨床研究作支撐。