全子宮切除術(shù)對(duì)BALB/c小鼠TDAR實(shí)驗(yàn)的影響①

常鵬環(huán) 黃守國 林 鈴 于欣榮 林莉香 楊照新

(?？谑腥嗣襻t(yī)院婦產(chǎn)科，?？?70208)

近代研究表明全子宮切除術(shù)可造成卵巢功能衰退，引起雌激素水平下調(diào)[1-3]。而雌激素除了對(duì)生殖系統(tǒng)的影響外，越來越多的研究顯示其對(duì)免疫系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。本研究通過制備BALB/c種小鼠全子宮切除術(shù)模型動(dòng)物，考察該術(shù)式對(duì)小鼠T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)(TDAR)實(shí)驗(yàn)的影響，并對(duì)術(shù)后外周血B淋巴細(xì)胞亞群及卵巢形態(tài)學(xué)等指標(biāo)進(jìn)行研究和分析，以探討該術(shù)式對(duì)小鼠免疫功能的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠24只，體重18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(湘)2016-0002；所有動(dòng)物飼養(yǎng)及無菌手術(shù)均在海南省藥物安全性評(píng)價(jià)研究中心屏障設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(瓊)2016-0013；所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均經(jīng)海南省藥物安評(píng)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)購自Sigma公司；不同熒光標(biāo)記的流式抗體CD3-Percp、CD19-FITC均購自美國BD公司；雌二醇ELISA檢測(cè)試劑盒(Estradiol parameter assay KIT)購自美國RD公司；酶標(biāo)二抗(Goat anti-mouse IgG/HRP)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及全子宮切除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立 將BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為平行對(duì)照組，非手術(shù)組和手術(shù)組，每組8只；術(shù)前12 h禁食禁飲，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食；非手術(shù)組不予任何處理；平行對(duì)照和手術(shù)組經(jīng)腹行全子宮切除術(shù)，麻醉成功后，無菌條件下在下腹正中切口，暴露子宮，分離左右側(cè)雙角子宮及子宮頸，然后在子宮頸口與陰道連接部位進(jìn)行結(jié)扎，摘除子宮，縫合皮膚并消毒。

1.2.2KLH免疫方法 術(shù)后第15天，非手術(shù)組和手術(shù)組經(jīng)腹腔注射鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)，首次免疫后第7天加強(qiáng)免疫1次，平行對(duì)照組不予注射KLH；于術(shù)后第30天，摘眼球采EDTA-2K抗凝血和血清。

1.2.3小鼠TDAR試驗(yàn)檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)以KLH為特異性抗原進(jìn)行小鼠TDAR試驗(yàn)檢測(cè)，具體操作為：應(yīng)用KLH作為抗原免疫BALB/c小鼠，連續(xù)免疫2次，免疫劑量均為2.5 g/kg；采用間接ELISA法檢測(cè)血中KLH特異性IgG抗體含量，其中Goat Anti-Mouse IgG/HRP抗體稀釋倍率1∶4 000，待檢血清稀釋倍率為1∶800，抗原包被濃度為10 μg/ml；每個(gè)待檢樣品均設(shè)復(fù)孔；實(shí)驗(yàn)結(jié)果以O(shè)D值表示。

1.2.4其他指標(biāo)檢測(cè)方法 采用ELISA法檢測(cè)外周血清雌二醇含量；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血B淋巴細(xì)胞百分比；分離左右側(cè)卵巢，4%中性甲醛固定，常規(guī)HE染色。

2 結(jié)果

2.1KLH能夠刺激BALB/c雌性小鼠外周B淋巴細(xì)胞分化增殖 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLH能夠明顯刺激手術(shù)組(圖1C)和非手術(shù)組小鼠(圖1B)B淋巴細(xì)胞分化增殖，與未給予KLH的平行對(duì)照組(28.96%±3.77%)(圖1A)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1D)；雖然手術(shù)組(37.11%±2.68%)和非手術(shù)組(34.10%±5.25%)之間比較無明顯差異(P>0.05)，但手術(shù)組B淋巴細(xì)胞百分比較非手術(shù)組稍高，機(jī)體可能存在代償反應(yīng)。

2.2全子宮切除術(shù)能夠下調(diào)BALB/c雌性小鼠血清KLH IgG抗體生成 血清KLH IgG抗體檢測(cè)結(jié)果表明，全子宮切除術(shù)能夠降低手術(shù)組血清KLH IgG抗體生成量，手術(shù)組(0.817 0±0.315 0)和非手術(shù)組相比(1.135 8±0.298 4)(圖2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；手術(shù)組(0.817 0±0.315 0)和非手術(shù)組(1.135 8±0.298 4)與平行對(duì)照組(0.431 8±0.102 3)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3全子宮切除術(shù)能夠降低BALB/c雌性小鼠卵巢雌二醇的分泌 通過ELISA法檢測(cè)外周血雌二醇含量，發(fā)現(xiàn)全子宮切除術(shù)能夠下調(diào)手術(shù)組和平行對(duì)照組雌二醇生成，手術(shù)組(35.59±8.24)pg/ml和平行對(duì)照組(33.38±9.39)pg/ml相比非手術(shù)組(51.06±10.97)pg/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；手術(shù)組和平行對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4全子宮切除術(shù)能夠引起卵巢組織形態(tài)學(xué)改變 肉眼觀卵巢體積縮小，鏡下多數(shù)卵泡形態(tài)不規(guī)則，可見偏位，顆粒細(xì)胞松散、固縮，部分凋亡，見圖4。

圖1 各組外周血B淋巴細(xì)胞百分比Fig.1 Percentage of B lymphocyteNote: *.P<0.05.

圖2 各組血清KLH IgG抗體含量Fig.2 Concentration of serum KLH IgGNote: *.P<0.05.

圖3 各組血清雌二醇含量Fig.3 Concentration of serum estradiolNote: *.P<0.05.

圖4 各組卵巢組織形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果(HE染色，×200及×400)Fig.4 Result of ovarian histomorphological changes(HE staining,×200 and ×400)Note: B.The no-operated group was normal ovarian tissue；A and C.In the parallel control and operated group,the size of the ovary was reduced,and the number of mature follicles was decreased under the microscope.Most of the follicles were irregular,and the granulosa cells were loose,pyknosis and some apoptosis.

3 討論

雌二醇雖然為脂溶性的類固醇性激素，卻對(duì)多個(gè)組織器官有影響，近代研究顯示其對(duì)免疫系統(tǒng)也有著重要的調(diào)節(jié)作用，在DC細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)雌激素受體(ER)，這些證據(jù)表明雌激素與免疫系統(tǒng)有著非常重要的聯(lián)系[4，5]。同時(shí)越來越多的證據(jù)表明子宮也能分泌細(xì)胞因子、酶和生物活性物質(zhì)，對(duì)維持機(jī)體的生理、病理過程有著極其重要的作用[6]。另外，子宮切除術(shù)后由于鄰近血管的結(jié)扎，破壞卵巢與子宮之間的解剖學(xué)和功能學(xué)的完整性，使術(shù)后卵巢的血液供應(yīng)減少，造成卵巢功能的衰退，血清雌激素水平下降[2-4]。這種卵巢功能的衰退和血供減少，在組織形態(tài)上主要表現(xiàn)為卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量減少及細(xì)胞凋亡、間質(zhì)增生等[7]。本研究中也發(fā)現(xiàn)手術(shù)組和平行對(duì)照組小鼠卵巢多數(shù)卵泡形態(tài)不規(guī)則，可見偏位，顆粒細(xì)胞松散、固縮、部分凋亡，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

為了考察全子宮切除術(shù)是否對(duì)BALB/c種小鼠免疫功能產(chǎn)生影響，本研究以KLH為特異性抗原考察小鼠全子宮切除術(shù)對(duì)TDAR實(shí)驗(yàn)的影響，發(fā)現(xiàn)該術(shù)式可以下調(diào)手術(shù)組小鼠外周血KLH IgG抗體含量，與非手術(shù)組相比存在明顯差異，但高于平行對(duì)照組(未給予KLH)，提示全子宮切除術(shù)能夠抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)，減少KLH特異性抗體生成。TDAR實(shí)驗(yàn)是B淋巴細(xì)胞針對(duì)T細(xì)胞依賴性抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，需要Th2淋巴細(xì)胞協(xié)助完成。KLH進(jìn)入機(jī)體以后，誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，由巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞活化Th2細(xì)胞，后者輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，上述過程包括抗原處理、遞呈、B細(xì)胞分化增殖、細(xì)胞因子分泌等一系列反應(yīng)步驟，任何步驟出現(xiàn)問題，均可造成抗體生成異?！，F(xiàn)代研究表明免疫系統(tǒng)與卵巢功能關(guān)系密切、相互作用，例如：雌激素調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的途徑，主要通過T淋巴細(xì)胞雌激素受體α介導(dǎo)完成[8]；Kumru等[9]證實(shí)經(jīng)腹子宮全切術(shù)后患者的淋巴細(xì)胞亞群CD4+CD8+細(xì)胞的比例降低和細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ降低，進(jìn)一步說明了雌激素可能具有重要的免疫功能調(diào)節(jié)作用。而本研究通過檢測(cè)外周血清雌二醇含量發(fā)現(xiàn)：全子宮切除術(shù)可使手術(shù)組和平行對(duì)照組小鼠外周血雌二醇含量明顯降低，進(jìn)一步說明全子宮切除術(shù)能夠通過抑制雌二醇的分泌，下調(diào)機(jī)體對(duì)外來性抗原免疫應(yīng)答的能力，從而影響機(jī)體免疫功能。

非常有意思的是本研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)組和非手術(shù)組小鼠外周血B淋巴細(xì)胞雖然無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但是手術(shù)組B淋巴細(xì)胞所占百分比要比非手術(shù)組高一些，這種現(xiàn)象可能與機(jī)體代償調(diào)節(jié)有關(guān)，KLH進(jìn)入機(jī)體后可刺激B淋巴細(xì)胞分化增殖，但由于手術(shù)組雌激素分泌水平較低，抗體生成減少，導(dǎo)致機(jī)體代償刺激B淋巴細(xì)胞分化增殖更多一些，具體機(jī)制后期將進(jìn)一步研究。

綜上所述，全子宮切除術(shù)能夠通過降低BALB/c種小鼠雌激素分泌水平，降低機(jī)體對(duì)外來抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的敏感性，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫功能。關(guān)于雌激素是如何誘導(dǎo)DC細(xì)胞，影響B(tài)淋巴細(xì)胞減少抗體分泌的分子機(jī)制將在后期進(jìn)行深入研究。