PbGPI16在C57BL/6小鼠腦瘧發(fā)病過程中作用的研究①

邱 悅 劉慶陽 朱曉彤 曹雅明

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管超聲科，沈陽110001)

瘧疾是通過蚊媒傳播的寄生原蟲感染性疾病，其并發(fā)癥腦瘧是造成感染患者死亡的主要原因。研究結(jié)果顯示，瘧疾感染后宿主過度的免疫應(yīng)答是誘發(fā)腦瘧癥狀的主要原因。有研究證實(shí)TNF-α、IFN-γ與 IL-1β等在瘧疾感染后升高的前炎癥因子是可引起宿主嚴(yán)重的病理改變[1]。同時，瘧疾感染后宿主體內(nèi)表達(dá)上調(diào)的CXCL9、CXCL10和CXCR3等趨化因子可以造成瘧原蟲感染紅細(xì)胞(pRBCs)、白細(xì)胞和血小板趨化并黏附于腦微血管壁，進(jìn)而導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血腦屏障破壞，從而誘發(fā)腦瘧[2]。此外，瘧原蟲自身組分亦可引起感染宿主嚴(yán)重的病理反應(yīng)，例如瘧原蟲核酸、瘧色素和原蟲糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositols,GPIs)。其中GPIs是糖脂復(fù)合體，可協(xié)助錨定細(xì)胞膜表面蛋白從而發(fā)揮生物學(xué)作用。惡性瘧原蟲感染后，原蟲GPIs通過與TLRs相互作用，激活宿主酪氨酸激酶和蛋白激酶C調(diào)節(jié)下游前炎癥因子的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致腦瘧[3]。 鼠瘧研究表明，原蟲GPIs和GPI錨定蛋白可引起促炎因子的產(chǎn)生并引發(fā)發(fā)熱及腦瘧癥狀[4]。因此，原蟲GPIs和GPI錨定蛋白為宿主免疫系統(tǒng)作用的靶位。

GPI錨定蛋白的合成均始于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其合成過程主要通過GPI-T介導(dǎo)的轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)[5]。GPI-T的各種亞基均通過自身跨膜或者與其他亞基結(jié)合的方式鑲嵌于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。所有的GPI錨定蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成時蛋白羧基末端均含有GPI錨定蛋白信號肽[6]。這類信號肽在轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，但各蛋白之間不盡相同[7]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)后，GPIs連接后的GPI錨定蛋白通過高爾基體途徑運(yùn)輸至細(xì)胞膜[8]。其中GPI-T復(fù)合體功能的完整性在GPIs及GPI錨定蛋白的合成及運(yùn)輸至關(guān)重要。

前期研究中我們發(fā)現(xiàn)PbGPI16是Pb.ANKA中GPI-T復(fù)合體中的組成亞基之一，在多種瘧原蟲種屬中均高度保守。在伯氏瘧原蟲pbgpi16基因敲除株(△pbgpi16)的裂殖子表面MSP1、MSP4和MSP10等GPI錨定蛋白的數(shù)量均有減少[9]。本研究中，通過與野生型WT組相比，△pbgpi16基因敲除蟲株感染宿主后，宿主前炎癥反應(yīng)明顯下降，且△pbgpi16感染C57BL/6小鼠不能成功建立ECM模型。綜上，PbANKA原蟲PbGPI16蛋白在ECM病理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

1 材料與方法

1.1材料 40只6～8周齡，雌性C57 BL/6小鼠，購自北京動物所。伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei ANKA蟲株2.34， PbANKA)由中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室保存。4%的多聚甲醛(北京鼎國)。RNA提取試劑盒(康為世紀(jì))?；蚪MRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)。MSD Proinflammatory Panel 1 cytokine assay kits試劑盒 (Mesoscale，Rockville，USA)。測量細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，USA)。以下抗體均購自BD Biosciences：FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體(clone 2.4G2)、FITC-anti-CD11c(clone HL3)、PE-anti-MHCⅡ(clone H1.2F3)、PE-anti-TLR4(clone GL1)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒑湍X組織HE染色 雌性:C57BL/6小鼠分別采用腹腔注射方式感染1×106的PbANKA(WT)或PbANKA△pbgpi16(△pbgpi16)的pRBCs。吉姆薩染色的尾血薄血膜法鏡檢感染率并每日觀察死亡率。當(dāng)WT組小鼠感染后第6天(d6)出現(xiàn)神經(jīng)性癥狀時，每組各取5只小鼠處死。取出鼠腦并用4%的多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋室溫凝固。腦組織連續(xù)取5 μm厚切片，60℃烤片12 h，梯度脫蠟脫苯后采用3%檸檬酸鈉90℃ 15 min 抗原修復(fù)。組織切片進(jìn)行蘇木素伊紅染色(HE)檢測微血管梗阻和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，取血管中有白細(xì)胞浸潤血管為陽性。

1.2.2RNA提取和實(shí)時定量PCR(qPCR) WT或△pbgpi16感染后d2、d4、d6和d8，分別取各組小鼠5只，處死后解剖感染小鼠腦組織及脾組織進(jìn)行相關(guān)炎癥因子及趨化因子檢測。腦組織及脾組織RNA提取方法如組織RNA提取試劑盒說明書，提取RNA置于-80℃待用。PbA-WT或△pbgpi16組各取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA存放于-20℃待用。采用qPCR方法檢測小鼠腦中CXCL9、CXCL10、CXCR3和脾中TNF-α、IFN-γ和 IL-1β的表達(dá)水平，β-actin設(shè)為內(nèi)參。

1.2.3血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子檢測 于小鼠感染W(wǎng)T或△pbgpi16后d2、d4、d6和d8分別取各組小鼠5只，處死后解剖感染小鼠脾組織及血清進(jìn)行相關(guān)炎癥因子檢測，其中用MSD Proinflammatory Panel 1 cytokine assay kits試劑盒來測量血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的水平。實(shí)驗(yàn)通過高通量法檢測小鼠血清中的各種炎癥因子變化情況。每組均設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，細(xì)胞因子的濃度用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算(pg/ml)。 脾組織經(jīng)研磨后，用0.17 mol/L氯化銨裂解紅細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次后，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，脾細(xì)胞1×106/孔，37℃培養(yǎng)48 h。收集脾細(xì)胞培養(yǎng)上清用于脾細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β的定量分析。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù) 于小鼠感染W(wǎng)T或△pbgpi16后d2、d4、d6和d8分別取各組小鼠5只，分離脾細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。取5×106脾細(xì)胞，采用FITC-anti-CD11c和PE-anti-MHCⅡ或 PE-anti-TLR4進(jìn)行細(xì)胞膜雙染標(biāo)記DCs，染色結(jié)束細(xì)胞PBS洗滌后重懸4℃保存，待流式細(xì)胞儀檢測。染色細(xì)胞用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)進(jìn)行分析，各組均設(shè)抗體單標(biāo)記及陰性對照，細(xì)胞檢測數(shù)為100 000。用FlowJo軟件(TreeStar)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1PbGPI16缺陷降低C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性腦瘧發(fā)病率 WT組小鼠在d6出現(xiàn)神經(jīng)性癥狀，并在d5至d12之間出現(xiàn)死亡(圖1A)。<30%的△pbgpi16感染組小鼠死于實(shí)驗(yàn)性腦瘧，>70%小鼠在感染后d12始出現(xiàn)死亡。與WT組相比，△pbgpi16感染的小鼠在各檢測時間點(diǎn)呈現(xiàn)出相對較低的原蟲血癥(圖1B)。

2.2△pbgpi16感染小鼠實(shí)驗(yàn)性腦瘧病理改變降低 為明確ECM的病理損傷程度，采用免疫組化方法常規(guī)檢測腦血管壁完整性[10]。通過HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，△pbgpi16感染小鼠的腦組織中白細(xì)胞浸潤血管數(shù)明顯少于WT組小鼠(圖2)。

2.3Δpbgpi16感染小鼠腦組織和脾細(xì)胞中趨化因子和前炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平下降 qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在△pbgpi16感染小鼠腦組織中CXCL9、CXCL10和CXCR3轉(zhuǎn)錄水平降低(圖3)。與WT組小鼠相比，△pbgpi16感染小鼠脾組織中TNF-α、IFN-γ和IL-1β的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降(圖3)。

圖1 伯氏瘧原蟲PbGPI16缺失降低C57BL/6小鼠ECM發(fā)病率Fig.1 PbGPI16 deficient reduce ECM morbidityNote: A.Parasitemia;B.Survival rate.

圖2△pbgpi16感染小鼠ECM的腦病理損傷減少

Fig.2PathologicaldamageofECMinmiceinfectedwith△pbgpi16decreased

Note: During the statistical process,the microvasculature changes were observed in 20 visual fields under each microscope in each mouse,and 5 mice in each group were randomly compared with the normal control group.*.P<0.05,**.P<0.01,#.P<0.05.

2.4△pbgpi16感染小鼠前炎癥反應(yīng)下降 WT組中腦瘧相關(guān)前炎癥因子于感染后開始升高，在第4到6天出現(xiàn)ECM癥狀時達(dá)到高峰(圖4)。與WT組小鼠相比，△pbgpi16感染小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ和IL-1β的表達(dá)水平明顯下降。血清中上述細(xì)胞因子通過MSD方法檢測，結(jié)果顯示相對于WT組，△pbgpi16感染小鼠的血清中上述細(xì)胞因子濃度均顯著下降(圖4)。

2.5PbGPI16缺陷瘧原蟲感染C57BL/6小鼠脾組織中樹突狀細(xì)胞的分化成熟顯著延遲采用FACS計(jì)數(shù)各組感染小鼠不同時間點(diǎn)相關(guān)樹突細(xì)胞變化情況(圖5)。流式結(jié)果表明WT和△pbgpi16組中，感染后d2小鼠脾組織中DCs均開始活化，并表達(dá)MHCⅡ分子及TLR4分子。但△pbgpi16感染小鼠脾組織中成熟的DCs(CD11c+MHC+)及表達(dá)TLR4分子的DCs(CD11c+TLR4+)細(xì)胞絕對數(shù)較WT組小鼠明顯下降。

圖3 腦組織和脾組織中趨化因子和細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)水平Fig.3 mRNA expression levels of chemokines and cytokines in brain tissues and splenic tissuesNote: A-C.The transcriptional level of CXCL9,CXCL10 and CXCR3 mRNA at different time points in brain tissue；D-F.mRNA transcriptional level of TNF-α,IFN-γ and IL-1β at different time points in spleen tissue.*.P<0.05,**.P<0.01,#.P<0.05,##.P<0.01.

圖4 血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α，IFN-γ和IL-1β的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of TNF-α,IFN-γ and IL-1β in serum and splenocytes supernatantNote: A,C,E.The levels of TNF-α,IFN-γ and IL-1β at different time points in infected mice serum；B,D,F.The changes of TNF-α,IFN-γ and IL-1β at different time points in splenocytes supernatant.n=5.*.P<0.05，**.P<0.01.

圖5 WT和△pbgpi16組小鼠脾組織中表達(dá)MHCⅡ及TLR4分子DCs計(jì)數(shù)Fig.5 Expression of MHCⅡ and TLR4 DCs in spleen tissue of mice in WT and △pbgpi16 groupNote: A.The percentage of CD11c+ MHCⅡ+ cells；B.The percentage of CD11c+ TLR4+ cells；C.The absolute number of CD11c+ MHCⅡ+ cells；D.The absolute number of CD11c+ MHCⅡ+ cells.*.P<0.05 and **.P<0.01 indicates significant differences between the experimental group and the normal mice.##.P<0.01,indicates significant differences between WT and △pbgpi16 group mice.

3 討論

腦瘧的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前已明確宿主過度的保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)是誘發(fā)腦瘧的免疫學(xué)基礎(chǔ)[11]。瘧原蟲GPIs及GPI錨定蛋白可引發(fā)前炎癥反應(yīng)[12]。生物信息學(xué)分析顯示PbGPI16是伯氏瘧原蟲GPI-T復(fù)合體中的亞基之一。免疫印跡和免疫熒光方法檢測顯示，pbgpi16基因敲除瘧原蟲蟲株(△pbgpi16)的MSP1、MSP4和MSP10在細(xì)胞膜表面錨定數(shù)量明顯減少。MSP1、MSP4、MSP10均為瘧原蟲裂殖子表面的GPI錨定蛋白[13]，故我們推測△pbgpi16瘧原蟲蟲體內(nèi)GPI-T復(fù)合體的功能受損，轉(zhuǎn)運(yùn)至原蟲表面的GPIs和GPI錨定蛋白下降，從而導(dǎo)致△pbgpi16激活宿主免疫反應(yīng)的能力下調(diào)。

大量研究證實(shí)，前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子參與腦瘧免疫應(yīng)答[14]。瘧原蟲的GPIs及GPI錨定蛋白可以刺激宿主淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ，高濃度的TNF-α和IFN-γ進(jìn)而促進(jìn)CXCL9、CXCL10和CXCR3的表達(dá)，導(dǎo)致腦內(nèi)的T淋巴細(xì)胞病理性堆積[15]。本研究通過對比野生型PbA感染的小鼠發(fā)現(xiàn)，在△pbgpi16蟲株感染的C57BL/6小鼠血腦屏障損傷程度明顯下降，且感染小鼠腦內(nèi)CXCL9、CXCL10和CXCR3等趨化因子mRNA表達(dá)水平也明顯低于野生型PbA感染小鼠。同時，△pbgpi16蟲株感染的C57BL/6小鼠脾組織中TNF-α、IFN-γ和IL-1β的表達(dá)亦明顯下調(diào)。IL-1β可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生前列腺素并且引起發(fā)熱等瘧疾相關(guān)臨床癥狀[16]。上述細(xì)胞因子在△pbgpi16蟲株感染的C57BL/6小鼠脾組織中轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)可能是宿主不發(fā)生腦瘧癥狀的主要原因。同時，△pbgpi16感染小鼠血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-1β的低表達(dá)與△pbgpi16感染小鼠腦中微血管的病理性損傷和ECM相關(guān)癥狀減輕相符。

在瘧疾感染過程中，DCs細(xì)胞通過TLRs被激活[17]?；罨疶LRs可以激活自噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ進(jìn)而促進(jìn)宿主體內(nèi)Th1細(xì)胞的分化[18]。有研究表明，在惡性瘧原蟲感染的過程中，瘧原蟲GPIs與GPI錨定蛋白主要通過TLR2和TLR4介導(dǎo)宿主體內(nèi)相關(guān)前炎癥反應(yīng)[19]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與野生型PbA感染小鼠比較，△pbgpi16感染小鼠的DCs細(xì)胞表面參與抗原提呈的MHCⅡ和TLR4表達(dá)顯著下降，提示△pbgpi16原蟲激活宿主DCs活化能力下降。瘧疾感染過程中以CD4+T細(xì)胞為主導(dǎo)的前炎癥免疫應(yīng)答需要DCs提呈原蟲抗原，因此，△pbgpi16感染小鼠DCs活化水平下降可能是小鼠病理癥狀減輕的主要原因。

綜上所述，與野生型PbA感染小鼠相比，△pbgpi16原蟲感染小鼠血腦屏障損害明顯減輕?！鱬bgpi16基因敲除蟲株體內(nèi)GPI-T復(fù)合體中PbGPI16缺失導(dǎo)致GPI-T復(fù)合體結(jié)構(gòu)完整性破壞，致使瘧原蟲表面GPIs及GPI錨定蛋白數(shù)量減少， DCs活化水平下調(diào)，從而導(dǎo)致以Th1細(xì)胞為主的前炎癥反應(yīng)明顯下降，感染小鼠脾組織中的TNF-α、IFN-γ和IL-1β及腦中的CXCL9、CXCL10和CXCR3表達(dá)明顯下降，進(jìn)而小鼠感染瘧疾后腦瘧病理癥狀顯著減輕。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，瘧原蟲的PbGPI16在ECM的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。