甲氨蝶呤對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠Tfh細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究①

徐 琦 王 龍 顧丹今 伍 婷 任聰改 周 勇 程路峰

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830011)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種在世界范圍內(nèi)普遍存在的，以全身多個(gè)關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥和關(guān)節(jié)退化為主要表現(xiàn)，可致關(guān)節(jié)畸形或功能喪失的慢性自身免疫性關(guān)節(jié)疾病[1]。RA的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells，Tfh)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群[2]，研究表明Tfh與有些自身免疫病病情的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)[3]，且該細(xì)胞亞群主要輔助B細(xì)胞活化、增殖、分化和分泌免疫球蛋白，而大量高親和力抗體的分泌可誘發(fā)炎癥反應(yīng)[4]。Tfh表面表達(dá)的CXCR5+和ICOS可促進(jìn)B細(xì)胞分化及記憶B細(xì)胞的形成[5]。目前RA的臨床治療原則是緩解疼痛，減輕或緩解炎癥的發(fā)展,甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)作為慢作用抗風(fēng)濕藥，具有免疫抑制與抗炎癥的作用在臨床上廣泛使用[6,7]，但其在治療過(guò)程中對(duì)機(jī)體Tfh細(xì)胞的影響鮮有報(bào)道，本研究以膠原性關(guān)節(jié)炎小鼠模型為基礎(chǔ)，研究甲氨蝶呤治療RA的過(guò)程中對(duì)Tfh細(xì)胞數(shù)量表型、功能及轉(zhuǎn)錄因子的影響及其作用機(jī)制，為臨床用藥及配伍藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 牛Ⅱ型膠原及完全弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司；甲氨蝶呤購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；布洛芬購(gòu)自山西太原藥業(yè)有限公司；PE-Cy7標(biāo)記的CD3抗體、PerCP-Cy5.5標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的CXCR5抗體、FITC標(biāo)記的ICOS抗體均購(gòu)自eBioscience公司；ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience公司；免疫組化抗體購(gòu)自R&D公司；RNase-Free DNase I、TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ購(gòu)自天根生化科技有限公司。實(shí)驗(yàn)主要儀器有全波段酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)；凝膠成像儀、冰凍離心機(jī)。

1.2方法

1.2.1CIA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及分組 SPF級(jí)6周齡雄性BALB/c小鼠40只，體重18～20 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將40只BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、MTX組和布洛芬組，每組10只。CIA模型建立按照文獻(xiàn)稍加改進(jìn)[8]。將2 mg/ml的牛Ⅱ型膠原醋酸溶液與等體積CFA充分乳化，配制成 1 mg/ml的膠原乳劑，于小鼠背部、尾根部皮下多點(diǎn)注射膠原乳劑0.1 ml，初次免疫14 d后，在小鼠左后足跖皮下注射0.05 ml進(jìn)行二次免疫。對(duì)照組小鼠于相同部位，采用相同方法注射等量生理鹽水。初次免疫第1天起，每日觀察踝關(guān)節(jié)腫脹程度并進(jìn)行AI評(píng)分，記分標(biāo)準(zhǔn)為：0分無(wú)關(guān)節(jié)炎，1分發(fā)紅或輕微腫脹，2分中度腫脹，3分嚴(yán)重腫脹，4分嚴(yán)重腫脹且不能負(fù)重。初次免疫后28 d，各治療組行藥物灌胃治療，藥物劑量如下：甲氨蝶呤1 mg/kg，2次/周；布洛芬18 mg/(kg·d)；對(duì)照組：正常飼料喂養(yǎng)；治療28 d后處死小鼠。

1.2.2免疫組化檢測(cè) 組織包埋：摘眼球取血后處死小鼠。取脾臟進(jìn)行測(cè)量記錄后，10%多聚甲醛固定、石蠟包埋連續(xù)切片，厚度為4 μmol/L，進(jìn)行免疫組化染色。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果以隨機(jī)檢測(cè)5個(gè)視野下陽(yáng)性面積比，為每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞面積占整個(gè)視野面積的百分率，取其平均值，作為CXCR5的陽(yáng)性密度。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 外周血3 500 r/min離心20 min，分離上層血清，按照ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行細(xì)胞因子IL-21和IL-6的檢測(cè)。特異性抗體包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，加封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后加標(biāo)準(zhǔn)品及待檢血清，孵育2 h后洗滌加入相應(yīng)酶標(biāo)二抗，孵育1 h后洗滌，加入底物、顯色劑。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm/620 nm處的光密度值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù) 取小鼠脾細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光抗體染色：1×106細(xì)胞中分別加入PE-Cy7標(biāo)記的CD3抗體、PerCP-Cy5.5標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的CXCR5抗體、FITC標(biāo)記的ICOS抗體進(jìn)行熒光抗體染色，室溫孵育20 min,洗滌后重懸細(xì)胞；加每個(gè)樣品均設(shè)同型對(duì)照。樣品管置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.2.5RT-PCR Trizol提取脾臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)組織中轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和IL-21 mRNA表達(dá)水平，采用引物如下：Bcl-6上游引物:5′-CGTGAGGTCGTGGAGAACAAT-3′，下游引物：5′-ATGGGATAAGAGGCTGGTGGT-3′；IL-21上游引物:5′-CTATTTTCCCTGGAGTGGTATCA-3′,下游引物：5′-TGCTATCTTAGGGCGGTACAC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。用凝膠成像系統(tǒng)行光密度掃描半定量，與GAPDH 密度掃描值之比，作為評(píng)價(jià) mRNA 相對(duì)表達(dá)量的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1CIA小鼠關(guān)節(jié)AI評(píng)分 模型組小鼠免疫28～35 d 炎癥反應(yīng)達(dá)到高峰期，關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)腫脹充血，皮溫升高，足墊增厚，部分小鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)受限。35 d 后，模型組小鼠的AI評(píng)分逐漸呈下降趨勢(shì)。MTX組和布洛芬組小鼠在給藥后16 d開(kāi)始，關(guān)節(jié)腫脹程度顯著低于模型組(P<0.05)，但兩治療組間無(wú)明顯差異。給藥后28 d，MTX組和布洛芬組小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度較模型組明顯減輕，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以布洛芬的作用更為顯著，見(jiàn)圖1。

2.2脾臟組織中CXCR5+Tfh細(xì)胞數(shù)量及表型的變化 免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟中CXCR5+細(xì)胞陽(yáng)性密度顯著高于正常對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且CXCR5在脾小結(jié)的表達(dá)密度顯著增加。與模型組比較，MTX組及布洛芬組CXCR5+細(xì)胞密度明顯減少，尤其是脾小結(jié)中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，模型組脾臟中CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著升高，且Tfh細(xì)胞上的ICOS表達(dá)已顯著性升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MTX組及布洛芬組脾臟中CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與模型組相比Tfh細(xì)胞及活化分子ICOS的表達(dá)顯著下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)圖3。

圖1 大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分情況Fig.1 Arthritis index of different group in CIA miceNote:*.P<0.05 vs model group；**.P<0.01 vs model group.

圖2 CXCR5在各組小鼠脾臟中的表達(dá)Fig.2 Expression of CXCR5 in mouse spleenNote:A.Control group;B.Model group;C.Methotrexate group;D.Ibuprofen group.

圖3 脾臟中Tfh細(xì)胞的表達(dá)Fig.3 Expression of Tfh cell in mouse spleen

2.3血清細(xì)胞因子IL-21和IL-6含量的變化 與模型組相比，MTX組及布洛芬組小鼠血清IL-21 及IL-6水平明顯下降(P<0.05)；其中以布洛芬組血清細(xì)胞因子降低最為顯著(P<0.01)，治療組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.4脾臟中轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6及IL-21 mRNA的表達(dá) 模型組、MTX組和布洛芬組小鼠脾臟中轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，其中MTX組Bcl-6相對(duì)表達(dá)量與模型組相比有所升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組小鼠脾臟中轉(zhuǎn)錄因子IL-21的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)，而MTX組與布洛芬組小鼠IL-21的相對(duì)表達(dá)量與模型組及對(duì)照組相比均顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

表1血清中細(xì)胞因子的含量(pg/ml，n=10)

Tab.1Concentrationofcytokinesinserum(pg/ml，n=10)

GroupsIL-21IL-6Control18.61±4.2821.41±1.34Model40.49±3.121)58.36±3.381)Methotrexate32.11±6.061)2)40.56±2.931)2)Ibuprofen27.84±3.971)3)36.82±4.111)3)

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs model group;3)P<0.01 vs model group.

圖4 各組小鼠脾臟中Bcl-6 及IL-21 mRNA的表達(dá)Fig.4 Expression of Bcl-6 mRNA and IL-21 mRNA in mouse spleenNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的常見(jiàn)慢性、進(jìn)行性自身免疫性疾病,其病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，有大量證據(jù)表明Treg/Th17細(xì)胞亞群失調(diào)、兩類細(xì)胞分化及功能相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及IL-17表達(dá)異常與RA的病情密切相關(guān)。Tfh是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，表型為CD4+CXCR5+ICOS+，主要分布于淋巴濾泡 GC內(nèi)[9],其主要功能是輔助B細(xì)胞參與體液免疫，并能促進(jìn)GC的形成，在Ig類別轉(zhuǎn)換等方面也發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究認(rèn)為T(mén)h細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子B細(xì)胞淋巴因子-6(B-cell lymphokine-6，Bcl-6)調(diào)控下，可分化為T(mén)fh細(xì)胞，該細(xì)胞的關(guān)鍵特征是細(xì)胞膜表面持續(xù)表達(dá)CXCR5并分泌IL-21[10,11]。其表面表達(dá)的CXCR5+是Tfh 遷移、定位重要的轉(zhuǎn)運(yùn)分子,該分子使Tfh在 CXCL13趨化下，募集到淋巴濾泡促進(jìn)與B細(xì)胞的相互作用。IL-21是Tfh細(xì)胞主要功能分子，其與IL-6作用可影響轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6 mRNA的表達(dá)及Tfh的分化；此外,IL-21與表面分子ICOS還共同參與了調(diào)節(jié) B 細(xì)胞的分化，成熟以及Ig類別轉(zhuǎn)換。因此，Tfh細(xì)胞數(shù)量及相關(guān)分子表達(dá)異常可能與多種抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[12,13]。

甲氨蝶呤是臨床上應(yīng)用廣泛的慢作用抗風(fēng)濕藥，其具有免疫抑制與抗炎癥的作用[14]。本研究在成功建立CIA小鼠模型的基礎(chǔ)上，探討了甲氨蝶呤對(duì)CIA小鼠Tfh細(xì)胞的影響及其機(jī)制。研究結(jié)果顯示，CIA模型小鼠脾臟中Tfh細(xì)胞數(shù)量和表型發(fā)生變化：Tfh細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且廣泛分布于脾小結(jié)中心區(qū)域；且Tfh中ICOS的表達(dá)量進(jìn)一步增加。同時(shí)脾臟中轉(zhuǎn)錄因子IL-21的相對(duì)表達(dá)量及血清中IL-21和IL-6水平較對(duì)照組相比顯著升高，提示在RA發(fā)病中細(xì)胞因子IL-21可能通過(guò)促進(jìn)Tfh 的增殖，分化影響疾病的發(fā)生發(fā)展。甲氨蝶呤能有效緩解CIA小鼠關(guān)節(jié)的腫脹程度，使脾臟組織中的Tfh細(xì)胞數(shù)量減少，尤其是促進(jìn)了脾小結(jié)中Tfh細(xì)胞數(shù)量的顯著降低，且細(xì)胞表型中ICOS的表達(dá)量較模型組顯著降低。同時(shí)與模型相比甲氨蝶呤能顯著降低脾臟中轉(zhuǎn)錄因子IL-21的相對(duì)表達(dá)量及血清中IL-21和IL-6水平，以上結(jié)果提示甲氨蝶呤可能通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子IL-21的表達(dá)，降低血清中IL-21、IL-6的水平來(lái)影響機(jī)體Tfh細(xì)胞的數(shù)量、表型，及在脾小結(jié)中的分布來(lái)達(dá)到影響B(tài)細(xì)胞的分化及功能，從而減輕炎癥反應(yīng)。在RT-PCR結(jié)果中CIA模型組脾臟轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的相對(duì)表達(dá)量與實(shí)驗(yàn)預(yù)期有所不同，與對(duì)照組相比顯著降低，該結(jié)果與Tfh細(xì)胞在脾臟中數(shù)量增多不相吻合，同時(shí)甲氨蝶呤治療組Bcl-6的相對(duì)表達(dá)量與模型組相比有所升高，這可能與Tfh的分化涉及多因素有關(guān)，具體機(jī)制還要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的分析確證。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，甲氨蝶呤可減輕CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度，具有一定的抗炎作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子IL-21、血清細(xì)胞因子IL-21和IL-6表達(dá)水平，調(diào)節(jié)Tfh的數(shù)量及表型和分布，進(jìn)而影響B(tài)細(xì)胞的分化及功能。本研究初步探討了甲氨蝶呤在治療RA中對(duì)Tfh的影響，為臨床進(jìn)一步尋找治療RA的新策略及合理處方用藥提供了理論依據(jù)。