利心沖劑改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝的作用機(jī)制研究

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進(jìn)入21世紀(jì)以來，各種心臟疾病導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)病率仍然呈上升趨勢(shì)。近年來，調(diào)節(jié)衰竭心肌細(xì)胞能量代謝受到關(guān)注，有望成為治療心力衰竭的一種新策略[1]。研究顯示，心肌組織沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白(silent information regulator 2 homolog，Sirt1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gammaco-activator，PGC-1α)是參與心肌能量代謝的重要物質(zhì)，本研究觀察中藥利心沖劑調(diào)控心力衰竭大鼠模型心肌Sirti/PGC-1α的表達(dá)，探討利心沖劑改善心肌細(xì)胞能量代謝的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 利心沖劑：由黃芪、黃精、補(bǔ)骨脂、葶藶子、益母草按10∶5∶4∶4∶10的比例組成，采用江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的免煎顆粒。

試劑：磷酸肌酸(creatine phosphat，PCr)Elisa試劑盒，由上海源葉生物科技有限公司提供，批號(hào)：1600526。Sirt1抗體，由SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC公司提供，批號(hào)：A1324；PGC-1α抗體，由SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC公司提供，批號(hào)：A6384。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD大鼠80只，雄性，體重200 g～260 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。

1.2.2 造模及分組 參照文獻(xiàn)[2]，采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備心臟壓力負(fù)荷超載心力衰竭模型：SD大鼠術(shù)前禁食8 h，稱重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，常規(guī)備皮消毒，逐層打開腹腔，左側(cè)腎動(dòng)脈上方游離腹主動(dòng)脈，將8號(hào)注射器針頭磨鈍，平行置于腹主動(dòng)脈上，用4號(hào)手術(shù)線將腹主動(dòng)脈和注射器針頭一同結(jié)扎，然后緩慢撤出注射器針頭，關(guān)腹，分層縫合。假手術(shù)組僅開腹游離腹主動(dòng)脈，穿線不結(jié)扎。術(shù)后予青霉素腹腔注射5 d，預(yù)防感染。手術(shù)成功2周后從存活大鼠中隨機(jī)選取大鼠2只，斷頭處死，取出心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，取左心室心肌部分，以10%甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察確認(rèn)造模成功。

造模成功后將SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。假手術(shù)組、模型組給予等體積雙蒸水；利心沖劑低劑量組(低劑量組)給予利心沖劑20 g/kg；利心沖劑高劑量組(高劑量組)給予利心沖劑40 g/kg。各組大鼠灌胃給藥，每日1次，連續(xù)3個(gè)月。末次給藥后大鼠脫頸處死，取左心室心肌組織，-70 ℃溫箱保存?zhèn)溆?，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3 觀察項(xiàng)目及檢測(cè)方法

1.3.1 心肌勻漿PCr檢測(cè) 稱取左室心肌組織1 g，以2∶1比例加入冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS，4 ℃)，勻漿器迅速制備心肌勻漿，3 000 r/min離心5 min，取上清，-70 ℃溫箱保存。按PCr ELLSA檢測(cè)試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.3.2 Western-Blot法測(cè)定心肌勻漿Sirt1、PGC-1α蛋白表達(dá) 冰上裂解組織，手持式勻漿器勻漿，勻漿后BCA法測(cè)定各樣本的蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算各樣本電泳時(shí)的上樣量。使用10%預(yù)制SDS-PAVE凝膠，上樣本后以恒壓110 V進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后，以恒壓120 V進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉，之后孵育第一抗體，4 ℃過夜，清洗后孵育第二抗體2 h，凝膠成像系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光成像，保存數(shù)據(jù)為圖片，應(yīng)用Quantity One對(duì)各條帶進(jìn)行分析，計(jì)算出相對(duì)值后導(dǎo)出Excel表格做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 利心沖劑對(duì)心力衰竭大鼠心肌勻漿PCr的影響 與假手術(shù)組比較，模型組、利心沖劑低劑量組及利心沖劑高劑量組PCr含量均顯著降低(P<0.05)，提示心力衰竭時(shí)細(xì)胞內(nèi)PCr含量呈下降趨勢(shì)；與模型組比較，利心沖劑高劑量組PCr明顯升高(P<0.05)，說明利心沖劑治療能夠提高細(xì)胞中的PCr水平。詳見表1。

表1 各組大鼠PCr含量比較(±s)

2.2 利心沖劑對(duì)心力衰竭大鼠心肌組織Sirt1蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組、利心沖劑治療組中Sirt1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，說明心力衰竭時(shí)心肌組織內(nèi)Sirt1的含量呈下降趨勢(shì)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組與高劑量組中Sirt1蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05或P<0.01)，提示利心沖劑可以提高Sirt1表達(dá)水平。詳見圖1、圖2。

圖1 Sirt1蛋白表達(dá)電泳圖

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖2 Sirt1蛋白表達(dá)相對(duì)定量柱狀圖

2.3 利心沖劑對(duì)心力衰竭大鼠心肌組織PGC-1α蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組、利心沖劑治療組中PGC-1α蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，說明心力衰竭時(shí)心肌組織內(nèi)PGC-1α的含量呈下降趨勢(shì)，與模型組比較，利心沖劑低劑量組與高劑量組中PGC-1α蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05或P<0.01)，提示利心沖劑可以提高PGC-1α表達(dá)水平。詳見圖3、圖4。

圖3 PGC-1α蛋白表達(dá)電泳圖

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖4 PGC-1α蛋白表達(dá)相對(duì)定量柱狀圖

3 討 論

心力衰竭是各種心臟疾病的嚴(yán)重和終末階段，是世界范圍內(nèi)突出的公共衛(wèi)生問題[3]。近20余年，心力衰竭的治療模式已經(jīng)從改善血流動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种粕窠?jīng)內(nèi)分泌的過度激活，并取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。目前的治療雖然延緩了心力衰竭的進(jìn)程，但并未使得心力衰竭致殘率和病死率明顯下降。人們逐漸認(rèn)識(shí)到能量代謝貫穿于心肌從肥大到衰竭的全過程，是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展、惡化的重要因素之一[4-5]。

心肌正常的能量代謝是維持心臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和心臟舒縮功能的基礎(chǔ)[6]，三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)和PCr參與了心肌能量代謝，其中ATP是直接的供能物質(zhì)，PCr是主要的能量?jī)?chǔ)備。能量底物在線粒體通過三羧酸循環(huán)氧化磷酸化為ATP，后者被肌酸激酶(creatine kinase，CK)轉(zhuǎn)移并儲(chǔ)存在PCr中，PCr能在肌酸激酶的催化下及時(shí)轉(zhuǎn)化為ATP，補(bǔ)充心肌收縮時(shí)不斷消耗的ATP[7]。心力衰竭時(shí)ATP的合成受限，細(xì)胞內(nèi)ATP耗竭，PCr水平下降，心肌處于“能量饑餓狀態(tài)”[8]。Sirt1是酵母染色質(zhì)沉默子Sirt2在哺乳動(dòng)物中的同源體1，具有組蛋白去乙酰化酶活性[9]，與基因轉(zhuǎn)錄沉默、細(xì)胞生長(zhǎng)周期調(diào)節(jié)、能量代謝及壽命期限延長(zhǎng)有著密切的關(guān)系，還通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝、活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生、血管生成、細(xì)胞自噬及死亡等過程，在心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中起著重要的作用[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α是線粒體生物合成的中樞調(diào)節(jié)因子[11]，可促進(jìn)線粒體生物合成，增強(qiáng)不同組織細(xì)胞有氧呼吸功能，而線粒體參與了心臟能量產(chǎn)生和新陳代謝等重要生理過程，其功能障礙是導(dǎo)致心功能惡化的主要因素之一。Sirt1能夠通過去乙?；饔眉せ頟GC-1α，促進(jìn)線粒體的生物合成，調(diào)節(jié)線粒體的功能，從而調(diào)節(jié)能量代謝障礙、協(xié)調(diào)心臟舒縮功能，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[12]。Sirt1/PGC-1α途徑調(diào)控的線粒體功能可能是維持和修復(fù)心肌細(xì)胞的主要機(jī)制之一，在心力衰竭、心肌肥大等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。

慢性心力衰竭歸屬于中醫(yī)“胸痹”“喘證”等范疇，基本病機(jī)概括為心氣虛乏，心陽式微，瘀阻水停，其主要病理變化是虛、瘀、飲[13-14]。治宜益氣溫陽、活血利水。利心沖劑(黃芪、黃精、補(bǔ)骨脂、葶藶子、益母草)針對(duì)氣陽虛乏、絡(luò)脈瘀阻、水濕停聚三大基本病理變化，以黃芪和黃精補(bǔ)益心氣，補(bǔ)骨脂溫陽化氣，振奮心腎氣陽治其本；黃芪益氣利水，益母草活血利水，葶藶子瀉肺利水，通利水停瘀阻治其標(biāo)。前期臨床對(duì)照研究證實(shí)，與單純西藥治療比較，利心沖劑干預(yù)后病人生活質(zhì)量、射血分?jǐn)?shù)改善明顯，B型利鈉肽(BNP)下降[15]；作用機(jī)制研究也顯示，利心沖劑能改善大鼠心力衰竭模型心肌病理和血流動(dòng)力學(xué)；減少大鼠心肌組織神經(jīng)內(nèi)分泌因子的表達(dá)，降低血清血管緊張素Ⅱ水平；抑制心肌細(xì)胞凋亡；調(diào)控心肌組織金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)的表達(dá)、抑制由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)誘導(dǎo)的心肌膠原沉積和纖維化[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、利心沖劑低劑量組及利心沖劑高劑量組PCr含量均顯著降低(P<0.05)，表明心力衰竭大鼠存在能量代謝障礙；與模型組比較，利心沖劑高劑量組PCr明顯升高(P<0.05)，說明利心沖劑改善了心力衰竭大鼠的心肌能量代謝。模型組Sirt1及PGC-1α顯著下降，經(jīng)利心沖劑干預(yù)后，Sirt1及PGC-1α水平明顯上升，提示利心沖劑可能通過Sirt1/PGC-1α途徑，促進(jìn)線粒體增殖，從而調(diào)節(jié)線粒體的能量合成，改善了心肌細(xì)胞的能量代謝。中醫(yī)藥改善心肌能量代謝障礙或?qū)⒊蔀槁孕牧λソ咝碌难芯糠较颉?/p>