高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法測(cè)定血清中膽固醇及其6種代謝標(biāo)志物

黃雯雯, 勾新磊, 胡鐵靖, 胡光輝, 趙新穎

(北京市理化分析測(cè)試中心, 有機(jī)材料檢測(cè)技術(shù)與質(zhì)量評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100094)

人體血液中的膽固醇(cholesterol)濃度是高血脂癥的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。人體內(nèi)膽固醇的平衡主要通過(guò)內(nèi)源性肝臟合成和外源性腸道吸收兩個(gè)途徑。其中,血清中2,4-脫氫膽甾醇(desmosterol)、7-烯膽甾醇(lathosterol)和角鯊烯(squalene)是固醇前體,是反映人體內(nèi)源性膽固醇合成效率的膽固醇合成標(biāo)志物;菜油固醇(campesterol)、豆固醇(stigmasterol)和β-谷固醇(β-sitosterol)源自膳食植物,是反映機(jī)體外源性膽固醇吸收效率的膽固醇吸收標(biāo)志物[1-3],它們統(tǒng)稱(chēng)為膽固醇代謝標(biāo)志物,其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。血清中膽固醇的代謝標(biāo)志物比膽固醇能更早地反映人體膽固醇的代謝狀態(tài)[4,5],因此,準(zhǔn)確測(cè)定血清中膽固醇及其代謝標(biāo)志物的含量對(duì)血脂代謝異常的流行病學(xué)研究、臨床降脂藥物療效評(píng)價(jià)及膽固醇代謝研究具有重要意義。目前我國(guó)臨床常規(guī)檢驗(yàn)血清中的膽固醇普遍使用酶法[6],同時(shí)測(cè)定膽固醇及其代謝標(biāo)志物的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法尚無(wú)報(bào)道。血清中基質(zhì)復(fù)雜,膽固醇代謝標(biāo)志物的含量比膽固醇的含量更低,因此同時(shí)檢測(cè)膽固醇及其代謝標(biāo)志物必須具備高靈敏度和低檢出限的優(yōu)勢(shì)。文獻(xiàn)中報(bào)道的相關(guān)檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[7-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[10-15]、液相色譜法(LC)[16]以及液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-ESI-MS)[17]。但是這些方法存在的主要問(wèn)題是前處理復(fù)雜,樣品均需經(jīng)皂化及衍生處理后測(cè)定,操作繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng),測(cè)量結(jié)果誤差較大。

本文采用配有大氣壓化學(xué)電離源(APCI源)的高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(HPLC-Q/Orbitrap HRMS)對(duì)血清中的2,4-脫氫膽甾醇、7-烯膽甾醇、膽固醇、菜油固醇、豆固醇、β-谷固醇和角鯊烯進(jìn)行了定量檢測(cè)。采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴(lài)二級(jí)掃描(Full MS/dd MS2)監(jiān)測(cè)模式,通過(guò)提取目標(biāo)分子的一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)同時(shí)獲得定性和定量結(jié)果,通過(guò)自動(dòng)觸發(fā)獲得的二級(jí)全掃描數(shù)據(jù)進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確性。充分利用HPLC-Q/Orbitrap HRMS分辨率高、靈敏度高、檢出限低和抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn),建立了一種前處理方法簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的方法。

圖 1 膽固醇及其6種代謝標(biāo)志物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of cholesterol and its six metabolism markers

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料和試劑

Dionex UltiMate 3000高效液相色譜-Q Exactive四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),配有APCI源;Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國(guó)Waters公司); Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司); XPE105電子天平(d=0.01 mg,瑞士Mettler Toledo公司); Research plus可調(diào)量程移液器(1 000 μL,德國(guó)Eppendorf公司)。

膽固醇(純度≥99% )、7-烯膽甾醇(純度≥99% )和2,4-脫氫膽甾醇(純度≥84% )均購(gòu)自Sigma公司,豆固醇(純度>95% )、菜油固醇(純度>98% )和β-谷固醇(純度>98% )均購(gòu)自J&K,角鯊烯(>98.0% )購(gòu)自TCI公司,胎牛血清(優(yōu)級(jí)純)購(gòu)自浙江天航生物科技有限公司。甲醇、乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Merck公司。

血清樣品來(lái)自某醫(yī)院門(mén)診體檢合格者。早晨空腹抽血,經(jīng)分離膠采血管分離,4 000 r/min離心,靜置后取上層血清于-80 ℃中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱(chēng)取對(duì)照品,用乙腈溶解、定容,制得質(zhì)量濃度為 1 000 mg/L 的儲(chǔ)備液,4 ℃保存(有效期30天)。分別移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,工作溶液在每次使用前制備。

1.3 樣品前處理

血清使用之前于4 ℃冰箱中過(guò)夜解凍,移取血清樣品400 μL于1.5 mL離心管中,加入4 ℃乙腈600 μL,渦旋1 min,超聲5 min, 4 000 r/min 離心5 min,過(guò)0.22 μm濾膜到進(jìn)樣瓶中,上機(jī)測(cè)定(膽固醇的定量需稀釋 10 000 倍,單獨(dú)進(jìn)樣測(cè)定)。

1.4 儀器分析條件

色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相:80%(v/v)乙腈-20%(v/v)甲醇(A相)和水(B相);流速:0.4 mL/min;洗脫程序:95%A等度洗脫15 min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣室溫度:20 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

質(zhì)譜條件 離子源:APCI源;掃描模式:正離子;監(jiān)測(cè)模式:Full MS/dd MS2;掃描范圍(m/z): 50～450;一級(jí)分辨率:70 000 FWHM;二級(jí)分辨率:17 500 FWHM;鞘氣(N2)壓力:3.45×105Pa:輔助氣(N2)壓力:3.45×104Pa;放電電流:4.0 μA;離子傳輸管溫度:350 ℃;蒸發(fā)溫度:350 ℃;自動(dòng)增益:1×106; C-trap離子注入時(shí)間:50 ms;隔離窗口:m/z1.2;碰撞能:35 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

7種目標(biāo)物質(zhì)均屬于弱極性化合物,在C18色譜柱上強(qiáng)保留。根據(jù)相似相溶原理,流動(dòng)相中有機(jī)相含量高,極性弱,洗脫能力強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)考察了兩種色譜柱X Bridge BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm, Waters)和Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters)以及不同極性的流動(dòng)相組成(100%甲醇、100%乙腈、甲醇-乙腈(2∶8, v/v)、95%(v/v)的甲醇-乙腈(2∶8, v/v)-5%(v/v)水)對(duì)膽固醇及其6種代謝標(biāo)志物分離情況的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,適當(dāng)增加水的含量,可以使兩種同分異構(gòu)體達(dá)到基線分離,但進(jìn)一步增加水的含量時(shí),洗脫時(shí)間會(huì)增加,直至洗脫能力不足以讓所有的目標(biāo)物分子全部洗脫出來(lái);填料粒徑較小的色譜柱Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)在以95%(v/v)的甲醇-乙腈(2∶8, v/v)-5%(v/v)水做流動(dòng)相時(shí),等度洗脫15 min, 7種目標(biāo)物質(zhì)可以達(dá)到基線分離,保留時(shí)間隨分子極性的減弱依次增加。

圖2為該色譜條件下,以7種目標(biāo)化合物的實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)為提取離子的提取離子流圖。7-烯膽甾醇和膽固醇是一對(duì)同分異構(gòu)體,理論質(zhì)量數(shù)相同,實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)相差只有 0.000 47,在提取離子流圖上出雙峰,但是可以通過(guò)保留時(shí)間的不同加以區(qū)分。7種目標(biāo)化合物的實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間見(jiàn)表1。

圖 2 7種目標(biāo)物質(zhì)的提取離子流圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of the seven target compounds

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

APCI源比電噴霧電離源(ESI)更適合中低極性化合物[18],因此采用APCI源作為離子源。分別取7種目標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用流動(dòng)注射的方式注入質(zhì)譜的離子源,7種目標(biāo)物質(zhì)在正離子模式下產(chǎn)生強(qiáng)響應(yīng)信號(hào),因此本研究采用正離子模式。在一級(jí)質(zhì)譜分辨率為 70 000 FWHM時(shí),7種目標(biāo)物質(zhì)母離子的實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)偏差均小于5×10-6,符合定性要求。選擇Full MS/dd MS2模式,同時(shí)進(jìn)行一級(jí)全掃描和基于母離子列表的數(shù)據(jù)依賴(lài)二級(jí)質(zhì)譜掃描。以一級(jí)全掃描的母離子為定量離子,同時(shí)二級(jí)質(zhì)譜選擇兩個(gè)碎片離子作為定性離子,用于提高定性的準(zhǔn)確性。二級(jí)分辨率選擇 17 500 FWHM。7種目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 7種目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

2.3 提取條件的選擇

以胎牛血清作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,在7種目標(biāo)物質(zhì)的加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為膽固醇40 μg/L、角鯊烯 2 000 μg/L、其他5種代謝物(2,4-脫氫膽甾醇、7-烯膽甾醇、豆固醇、菜油固醇、β-谷固醇)200 μg/L 的加標(biāo)水平下分別考察了不同提取溶劑(5%(v/v)高氯酸、甲醇、甲醇-乙腈(50∶50, v/v)和乙腈)以及不同的血清樣品與提取溶劑的體積比(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3)對(duì)7種目標(biāo)物質(zhì)提取效果的影響。

2.3.1提取溶劑

不同提取溶劑對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的提取效果顯示,5%(v/v)高氯酸作為提取溶劑時(shí),提取率不足55% ;甲醇作為提取溶劑時(shí),提取率為73.4% ～86.7%;甲醇-乙腈(50∶50, v/v)作為提取溶劑時(shí),提取率為79.4% ～92.5% ,乙腈作為提取溶劑時(shí),提取率為89.3% ～99.7%(見(jiàn)圖3)。溶劑的極性越弱,提取效果越好。綜合考慮溶劑極性以及色譜柱適宜溶劑,選擇乙腈為提取溶劑。

圖 3 不同提取溶劑對(duì)7種目標(biāo)化合物提取率的影響Fig. 3 Effect of different extraction solvents on the extraction ratios of the seven target compounds

2.3.2血清樣品與提取溶劑的體積比

不同的血清樣品與提取溶劑的體積比(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3)對(duì)7種目標(biāo)物質(zhì)的提取效果考察結(jié)果顯示,血清樣品與提取溶劑的體積比為1∶1時(shí),提取率為75.4% ～90.1% ;血清樣品與提取溶劑的體積比為1∶1.5時(shí),提取率為89.3% ～99.7% ;血清樣品與提取溶劑的體積比為1∶2時(shí),提取率為89.3% ～99.7% ;血清樣品與提取溶劑的體積比為1∶3時(shí),提取率為89.4% ～99.8% 。隨著提取溶劑體積的增加,提取效率基本上呈現(xiàn)先增加后平衡的趨勢(shì)(見(jiàn)圖4),這可能是因?yàn)樵黾犹崛∪軇┑谋壤?目標(biāo)物溶出量增加,當(dāng)提取溶劑的比例進(jìn)一步增加時(shí),目標(biāo)物溶出量不再增加,為節(jié)約提取溶劑,選擇血清樣品與提取溶劑的體積比為1∶1.5。

圖 4 血清樣品與提取溶劑的體積比對(duì)7種目標(biāo)物提取率的影響Fig. 4 Effect of volume ratios of serum and solvent on the extraction ratios of the seven target compounds

表 2 7種目標(biāo)物質(zhì)的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4 方法的檢出限、定量限和線性范圍

將7種目標(biāo)物質(zhì)配制成一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在選定的色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,7種目標(biāo)物質(zhì)在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)(r2)均不小于0.992。使用Q/Orbitrap HRMS,用目標(biāo)物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量數(shù)提取離子流圖,無(wú)基線噪聲,無(wú)法采用傳統(tǒng)的S/N計(jì)算方法測(cè)定檢出限。因此,本方法將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋,得到儀器的檢出限(LOD),定量限(LOQ)為檢出限的3倍(見(jiàn)表2)。

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

在胎牛血清樣品中分別添加低、中、高水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為膽固醇10、20、40 μg/L,角鯊烯500、1 000、2 000 μg/L,其他5種代謝標(biāo)志物50、100、200 μg/L),進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn),每個(gè)濃度平行測(cè)定6次。結(jié)果(見(jiàn)表3)顯示,不同水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)中,各待測(cè)物的平均回收率為82.1% ～97.5% ,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6% ～7.4% ,滿(mǎn)足方法學(xué)要求。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用本方法對(duì)80個(gè)血清樣品進(jìn)行檢測(cè),膽固醇及其6種代謝標(biāo)志物均有檢出。其中,膽固醇含量最高,在1.31～1.89 g/L 范圍內(nèi),均在正常值范圍以?xún)?nèi)(醫(yī)學(xué)上規(guī)定的成年人正常值為1.12～2.32 g/L),平均值為1.61 g/L,比其他6種代謝標(biāo)志物高出3個(gè)數(shù)量級(jí)。角鯊烯在0.84～1.86 mg/L 之間,平均值為1.34 mg/L;其余5種代謝標(biāo)志物按照菜油固醇、7-烯膽甾醇、2,4-脫氫膽甾醇、豆固醇、β-谷固醇的順序依次降低,但是最高含量均低于1.00 mg/L (見(jiàn)圖5)。

圖 5 人血清樣品中膽固醇及其6種代謝標(biāo)志物的測(cè)定結(jié)果(n=80)Fig. 5 Determination results of cholesterol and its six metabolism markers in serum (n=80)

3 結(jié)論

利用乙腈超聲提取,以配有APCI源的HPLC-Q/Orbitrap HRMS分析,在30 min內(nèi)可完成血清中膽固醇及其6種代謝標(biāo)志物的測(cè)定。該法具有前處理相對(duì)簡(jiǎn)單,分析時(shí)間短,樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物無(wú)干擾,精密度和靈敏度高的優(yōu)勢(shì),且定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可以作為血清中膽固醇及其代謝標(biāo)志物測(cè)定的優(yōu)選方法。