藥物中磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)研究進(jìn)展

劉雪薇, 厲 程, 韓海云, 張文鵬, 陳東英*

(1. 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所, 上海 201203; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 上海藥品審評(píng)核查中心, 上海 201203)

基因毒性雜質(zhì)是指在藥物中以痕量水平存在,能夠和DNA發(fā)生反應(yīng)誘導(dǎo)DNA損傷,導(dǎo)致基因突變并有可能誘發(fā)癌癥的雜質(zhì)[1,2]。與藥物中其他類型的雜質(zhì)相比,基因毒性雜質(zhì)具有在極低暴露水平下即能導(dǎo)致嚴(yán)重毒性的特點(diǎn),因此對(duì)用藥的安全性造成嚴(yán)重的威脅?；撬狨ナ且活悵撛诘幕蚨拘噪s質(zhì),通常來源于藥物合成中磺酸或者其衍生物,如磺酰氯、磺酸酐和低級(jí)醇溶劑(如甲醇、乙醇、異丙醇等)之間發(fā)生的副反應(yīng)。由于磺酸鹽藥物應(yīng)用非常廣泛且其在合成中不可避免地會(huì)用到低級(jí)醇,使得磺酸酯在藥物中的殘留風(fēng)險(xiǎn)較為常見,因而備受人們關(guān)注。本文將首先對(duì)基因毒性雜質(zhì)相關(guān)的監(jiān)管法規(guī)進(jìn)行梳理,進(jìn)一步對(duì)磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的形成機(jī)理,控制策略以及相關(guān)的分析方法進(jìn)行綜述。

1 基因毒性雜質(zhì)監(jiān)管理念的演變

針對(duì)基因毒性雜質(zhì)給用藥帶來的安全隱患,各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的監(jiān)管理念主要經(jīng)歷了由追求完全避免、合理降低再到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估3個(gè)主要發(fā)展歷程[3,4]。

歐洲藥品管理局(European Medicines Agency, EMA)[5]最先出臺(tái)了關(guān)于基因毒性雜質(zhì)的控制法規(guī),其下屬的人用藥物委員會(huì)(原專利藥物委員會(huì))于2002年發(fā)布了一份關(guān)于基因毒性雜質(zhì)限度要求的咨詢意見書(Position paper on the limits of genotoxic impurities)。該意見書保守假設(shè)了基因毒性雜質(zhì)在任何暴露水平均能造成DNA損傷,因此任何濃度水平的基因毒性雜質(zhì)都會(huì)給用藥安全帶來風(fēng)險(xiǎn)?；诖思僭O(shè),該意見書要求制藥企業(yè)盡可能尋求不會(huì)產(chǎn)生基因毒性雜質(zhì)的“零風(fēng)險(xiǎn)”工藝路線;在達(dá)不到“零風(fēng)險(xiǎn)”要求的情況下,制藥企業(yè)需要提供足夠充分的理由,解釋無法避免基因毒性雜質(zhì)的原因,并在技術(shù)水平能達(dá)到的情況下盡可能地減少(as low as technically feasible, ALATF)藥物中基因毒性雜質(zhì)的殘留量。這份意見書給基因毒性雜質(zhì)的控制提供了初步的實(shí)施方案和標(biāo)準(zhǔn),但是它的保守性甚至是極端性也給制藥企業(yè)帶來了很大的挑戰(zhàn),在一定程度上阻礙了涉及相關(guān)藥物的研發(fā)進(jìn)程。在該意見書的基礎(chǔ)上,EMA和制藥企業(yè)進(jìn)行了多輪探討,于2006年頒布了《基因毒性雜質(zhì)限度指南》(Guideline on the limits of genotoxic impurities)[6]。該指南不再追求難以實(shí)現(xiàn)的“零風(fēng)險(xiǎn)”,首次引入了毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern, TTC)的概念,并采用“最低合理可行”(as low as reasonably practical, ALARP)原則代替ALATF。TTC是指由引起50%腫瘤發(fā)生率(TD50值,由最敏感物種的最敏感腫瘤部位獲得),通過簡(jiǎn)單線性外推至十萬分之一腫瘤發(fā)生率所對(duì)應(yīng)的基因毒性雜質(zhì)暴露量(不考慮DNA修復(fù)、細(xì)胞保護(hù)等因素帶來的影響)。通過線性外推,TTC值設(shè)定為1.5 μg/d,意味著當(dāng)每人每天所攝入的基因毒性雜質(zhì)的量小于1.5 μg時(shí),人一生中(按壽命為70年計(jì)算)患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)將小于十萬分之一。與之前尋求“零風(fēng)險(xiǎn)”的做法相比,TTC概念的引入對(duì)基因毒性雜質(zhì)的控制來說有了長(zhǎng)足進(jìn)步,標(biāo)志著對(duì)藥物中基因毒性雜質(zhì)的控制進(jìn)入了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的發(fā)展階段。然而,無論長(zhǎng)期用藥還是短期用藥,該指南都以1.5 μg/d 作為基因毒性雜質(zhì)的控制限度,該限度水平對(duì)于終生服藥的患者來說是可以接受的,但是對(duì)于短期暴露的藥物來說顯然還是過于保守。2006年1月,由輝瑞、強(qiáng)生、葛蘭素史克等國(guó)際制藥企業(yè)中的研發(fā)人員組成的美國(guó)藥物研究和制造商協(xié)會(huì)(Pharmaceutical Research and Manufacturers of America, PhRMA)專家小組在Lutz Müeller等的領(lǐng)導(dǎo)下首次提出了“階段化TTC”的概念,即原料藥中的基因毒性雜質(zhì)限度應(yīng)當(dāng)考慮藥物的暴露周期,暴露周期較短的藥物應(yīng)當(dāng)可以設(shè)定較高的控制限度[7]?！半A段化TTC”概念是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估科學(xué)理念的進(jìn)一步體現(xiàn),它的提出使得人們能夠根據(jù)用藥周期,科學(xué)、靈活地開展基因毒性雜質(zhì)的控制。

基因毒性雜質(zhì)通常含有某些特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)單元而具有高反應(yīng)活性,在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為高的生物活性,從而與DNA等功能分子發(fā)生反應(yīng)而引起毒性。這些特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)單元具有基因毒性的警示性,被稱為警示結(jié)構(gòu)[8,9]。常見的警示結(jié)構(gòu)主要包括芳香胺、醛、N-亞硝基胺、氨基甲酸類、環(huán)氧丙烷、氮雜環(huán)丙烷、肼、鹵代烷烴和磺酸酯等類型(見圖1)。Müeller等[7]將藥物中的雜質(zhì)按照結(jié)構(gòu)特性及誘變性和致癌性分成了5類,并提出了相應(yīng)的控制策略(見表1),為新藥研發(fā)及具體監(jiān)管的實(shí)施給出了更為合理的權(quán)衡方案。

圖 1 基因毒性雜質(zhì)警示結(jié)構(gòu)[7]Fig. 1 Alerting structures of genotoxic impurities[7] A: alkyl, aryl, or H; R: alkyl; EWG: electron withdrawing group (CN, C=O, ester, etc); PNAs: p-nitroaniline; PNAHs: polycyclic aromatic hydrocarbon.

表 1 按誘變性和潛在致癌性的雜質(zhì)分類及相應(yīng)的控制措施

EMA人用藥物委員會(huì)安全工作組就之前的《基因毒性雜質(zhì)限度指南》發(fā)布了相關(guān)的問答[10],該問答接納了Müeller等的提議,采用“階段化TTC”的方法來確立臨床研發(fā)中具有不同用藥周期要求的藥物中基因毒性雜質(zhì)的可接受攝入量。此外,該問答中回應(yīng)了對(duì)“ALARP”原則的質(zhì)疑,表示如果藥物中的基因毒性雜質(zhì)經(jīng)考察已經(jīng)低于規(guī)定的限度,則無需采用“ALARP”原則繼續(xù)降低藥物中基因毒性雜質(zhì)的殘留量,由此有效降低了分析方法建立或者轉(zhuǎn)移帶來的挑戰(zhàn)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)[11]于2008年12月也出臺(tái)了有關(guān)原料藥和制劑中基因毒性雜質(zhì)控制的指南草案(Guidance for industry-genotoxic and carcinogenic impurities in drug substances and products: recommended approaches)。該草案與EMA頒布的限度指南在服藥周期超過1個(gè)月至終生服藥時(shí)所涉及的TTC限度要求完全一致,而在服藥周期短于1個(gè)月的具體階段化TTC值規(guī)定則有所不同。ICH (the International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)[12]于2014年7月15日正式發(fā)布了基因毒性雜質(zhì)研究指南(M7),并在多次修改后于2017年5月31日出臺(tái)了第四版指南M7(R1),進(jìn)一步肯定了上述各方采用“階段化TTC”以及“五分類”策略對(duì)基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行研究和控制的科學(xué)性,并在這些策略的基礎(chǔ)上做了一定的調(diào)整和增補(bǔ)。

表2對(duì)比顯示了各監(jiān)管機(jī)構(gòu)及PhRMA對(duì)于基因毒性雜質(zhì)的控制要求?？梢钥吹紼MA和FDA的規(guī)定最為細(xì)致,且兩者對(duì)于具有1個(gè)月以上服藥周期的藥物監(jiān)管要求完全一致,而ICH的監(jiān)管要求相對(duì)而言較為寬松。在同樣12個(gè)月的服藥周期內(nèi),EMA和FDA都規(guī)定了每天不得超過5 μg的限度,而ICH的要求放寬到20 μg。在服藥周期12月以上時(shí),PhRMA、EMA和FDA規(guī)定基因毒性雜質(zhì)每天的可接受攝入量不得過1.5 μg,而ICH則要求只有服藥周期10年以上時(shí),才需限定每日攝入的基因毒性雜質(zhì)不得超過1.5 μg。究其原因,可能是由于ICH作為多方協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu),兼顧了多國(guó)的技術(shù)可行性。

PhRMA: pharmaceutical research and manufacturers of America; EMA: European Medicines Agency; FDA: U. S. Food and Drug Administration; ICH: the International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use.

針對(duì)藥物中存在多個(gè)誘變性雜質(zhì)的情況,M7(R1)也提出了相應(yīng)的監(jiān)管要求。當(dāng)藥物中含有多個(gè)1類雜質(zhì)時(shí),應(yīng)根據(jù)每個(gè)雜質(zhì)的特定限度分別對(duì)其進(jìn)行控制。當(dāng)藥物中含有兩個(gè)2類或3類雜質(zhì)時(shí),每個(gè)雜質(zhì)的控制仍然按照“階段化TTC”的原則控制,即藥物中的每個(gè)雜質(zhì)限度必須滿足表2的規(guī)定;然而,如果藥物中存在3個(gè)及以上2類或3類雜質(zhì),每個(gè)雜質(zhì)的可接受攝入量在滿足表2所述限度的同時(shí),所有雜質(zhì)的總量還需要根據(jù)表3進(jìn)行限定。

與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家相比,我國(guó)基因毒性雜質(zhì)的研究尚處于起步階段,目前也沒有直接出臺(tái)相關(guān)的指南,但是在當(dāng)下藥物研發(fā)全球化趨勢(shì)下,特別自2017年6月我國(guó)加入ICH組織以來,我國(guó)藥監(jiān)部門主要是參照上述國(guó)際主流指南開展藥物中的基因毒性雜質(zhì)的審批與監(jiān)管,以保證藥物質(zhì)量的可控性與臨床應(yīng)用的安全性。

2 磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)研究進(jìn)展

由于藥物與磺酸成鹽后具有溶解度增加、溶解速率加快、穩(wěn)定性增強(qiáng)、引濕性降低以及晶型更穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),且磺酸鹽藥物在改善有機(jī)弱堿性藥物的機(jī)械性質(zhì),諸如流動(dòng)性、黏合性、可壓縮性等方面也具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),因此通過與磺酸成鹽是一種提高有機(jī)弱堿藥物成藥性的重要手段[13]。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前處于臨床研發(fā)階段和已經(jīng)上市的磺酸鹽藥物有兩百余種(見表4),治療病癥包括嘔吐、哮喘、血栓、細(xì)菌感染、中風(fēng)、癌癥、艾滋病、抑郁癥等類型[14],由此可見磺酸鹽藥物的開發(fā)和市場(chǎng)應(yīng)用具有一定的普遍性和廣泛性?；撬猁}藥物由磺酸和藥物自由堿通過成鹽反應(yīng)得來,在合成過程中用到低級(jí)醇類溶劑(甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇等)時(shí),磺酸就可能與這些醇類溶劑發(fā)生副反應(yīng)產(chǎn)生磺酸酯雜質(zhì)。早在2000年,歐洲藥品質(zhì)量管理局(European Directorate for the Quality of Medicines, EDQM)即要求密切關(guān)注磺酸鹽藥物在成鹽過程中形成基因毒性雜質(zhì)磺酸酯的潛在風(fēng)險(xiǎn),并且要求除了要對(duì)甲磺酸鹽中的烷基磺酸酯進(jìn)行限度檢查外,還要提供其他相關(guān)的研究信息[15]。在這之后發(fā)生的甲磺酸奈非那韋因甲磺酸乙酯超標(biāo)而遭到撤市的事件[16],更是成為觸發(fā)歐洲藥監(jiān)部門和制藥企業(yè)高度關(guān)注磺酸酯基因毒性的標(biāo)志性事件。Roche公司通過對(duì)生產(chǎn)工藝的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)甲磺酸乙酯殘留超標(biāo)的原因是甲磺酸貯存罐清洗所用的乙醇未被完全清除,以較高的濃度水平殘留在貯存罐中,與存放其中的甲磺酸反應(yīng)生成了甲磺酸乙酯。在Roche公司解決了甲磺酸乙酯污染問題并對(duì)其毒性進(jìn)行評(píng)估后,歐洲藥品評(píng)價(jià)局才恢復(fù)了甲磺酸奈非那韋在歐洲的市場(chǎng)授權(quán)。該事件的發(fā)生不僅極大地危害了病人的健康,也給Roche公司造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

/: not reported.

除了磺酸和醇可能生成磺酸酯以外,磺酸的衍生物在與醇類溶劑共存時(shí)也可能會(huì)發(fā)生副反應(yīng)從而產(chǎn)生磺酸酯。如磺酰氯、磺酸酐等,其化學(xué)性質(zhì)活潑,在藥物合成中具有非常廣泛的用途,可作為良好的離去基團(tuán)、某個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)等參與化學(xué)反應(yīng);而且這些衍生物在重要的藥物合成前體——磺酰胺類化合物的合成中以及手性異構(gòu)體藥物的分離中也起著非常重要的作用,在這些化學(xué)反應(yīng)中,假如同時(shí)使用醇溶劑,就可能會(huì)發(fā)生副反應(yīng)而產(chǎn)生磺酸酯[17](見圖2)。

圖 2 磺酸、磺酸鹵化物、磺酸酐與低相對(duì)分子質(zhì)量醇反應(yīng)生成磺酸酯示意圖Fig. 2 Schematic generation of sulfonate esters between sulfonic derivatives and low relative molecular mass alcohols X=OH, Cl, Br, I, OSO2R; R=alkyl, phenyl; R′=alkyl.

由于醇類溶劑和磺酸及其衍生物的種類多樣,因此由兩者生成的磺酸酯包含多種結(jié)構(gòu),從最簡(jiǎn)單的烷基磺酸酯到復(fù)雜的芳基磺酸酯,主要有:甲磺酸酯,如甲磺酸甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯;苯磺酸酯,如苯磺酸甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯;對(duì)甲苯磺酸酯,如對(duì)甲苯磺酸甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯;三氟甲磺酸酯,如三氟甲磺酸甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯等(見圖3)。研究表明,磺酸酯具有誘變性,能夠直接或者經(jīng)代謝活化后間接地將自身結(jié)構(gòu)上的烷基殘基轉(zhuǎn)移到富電子的DNA堿基上而引起DNA的烷基化,從而導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的損傷[18,19]。

2.1 磺酸酯的形成機(jī)理及控制策略

圖 3 磺酸酯的種類Fig. 3 Categories of sulfonate esters

圖 4 甲磺酸和甲醇反應(yīng)機(jī)理[20]Fig. 4 Reaction mechanism between methanesulfonic acid and methanol[20]

由葛蘭素史克、阿斯利康等藥企研發(fā)人員組成的藥物質(zhì)量研究所工作組在Teasdale領(lǐng)導(dǎo)下,利用同位素(18O)標(biāo)記的方法,探究了甲磺酸和甲醇反應(yīng)生成甲磺酸甲酯的機(jī)理[20]。起初Teasdale等推測(cè)甲磺酸和甲醇的反應(yīng)機(jī)理有兩種可能途徑(見圖4),然而同位素測(cè)定結(jié)果顯示只在產(chǎn)物水中檢測(cè)到了18O,而產(chǎn)物甲磺酸酯中并不存在18O,說明甲磺酸和甲醇反應(yīng)生成甲磺酸甲酯的機(jī)理為圖4中所示的途徑A,即首先甲磺酸釋放質(zhì)子,形成甲磺酸根離子,同時(shí)甲醇質(zhì)子化形成氧鎓離子,然后甲磺酸根離子對(duì)該氧鎓離子進(jìn)行親核進(jìn)攻,生成甲磺酸甲酯和水。該反應(yīng)機(jī)理揭示了磺酸和醇反應(yīng)生成磺酸酯需要一定的酸性環(huán)境。接著Teasdale等[21]又繼續(xù)探討了反應(yīng)溫度,體系中的水分含量,溶液酸度等因素對(duì)磺酸酯生成和消除的影響,結(jié)果表明降低反應(yīng)溫度能顯著降低磺酸酯形成的速率和相應(yīng)產(chǎn)生的磺酸酯的水平;縮短醇和甲磺酸的反應(yīng)時(shí)間、增加水分的含量、增大反應(yīng)體系的pH也能夠有效減少磺酸酯的生成。他們的研究提供了盡可能降低磺酸酯水平的控制策略[22]:在磺酸鹽藥物成鹽過程中,盡量按照化學(xué)計(jì)量比投加磺酸和自由堿,同時(shí)為了促進(jìn)向成鹽反應(yīng)的正向進(jìn)行,采取加入過量自由堿而非磺酸的方式使反應(yīng)體系呈弱堿性,從而消除磺酸酯生成的風(fēng)險(xiǎn);如果必須要使用過量的磺酸,應(yīng)盡可能減少其用量并在較低的溫度下進(jìn)行成鹽反應(yīng)以及后續(xù)的分離操作,降低磺酸酯生成的速率;減少成鹽反應(yīng)和重結(jié)晶所用的時(shí)間,以此減少磺酸和醇類溶劑共存發(fā)生反應(yīng)的時(shí)間;向成鹽反應(yīng)和后續(xù)分離步驟所用的溶液中添加適量的水,減少質(zhì)子化醇的濃度,使酯化平衡反應(yīng)向逆反應(yīng)方向移動(dòng)以加速磺酸酯的水解;避免磺酸和醇在使用前預(yù)先混合和儲(chǔ)存的情況。這些策略為磺酸鹽藥物合成中磺酸酯的有效控制提供了重要參考,當(dāng)然要注意到這些措施可能對(duì)反應(yīng)收率帶來負(fù)面影響,需要在權(quán)衡各控制措施對(duì)藥物合成帶來的利弊基礎(chǔ)上進(jìn)行合理選擇與優(yōu)化。

2.2 磺酸酯相關(guān)分析方法

為了確保藥物的質(zhì)量安全,有必要建立準(zhǔn)確、耐用的分析檢測(cè)方法,對(duì)藥物中殘留的磺酸酯進(jìn)行定量測(cè)定并及時(shí)與合成工藝人員進(jìn)行反饋交流,以確保工藝路線的合理安全。目前文獻(xiàn)[23-43]報(bào)道的磺酸酯的分析方法主要有液相色譜(HPLC)法和氣相色譜(GC)法,相關(guān)方法的回收率和檢出限總結(jié)于表5中。

2.2.1液相色譜法

非揮發(fā)性的磺酸酯可采用HPLC進(jìn)行分析,其中具有紫外吸收的磺酸酯的檢測(cè)可采用紫外(UV)檢測(cè)器。為了提高檢測(cè)靈敏度,常常會(huì)進(jìn)一步選用選擇性和靈敏度更高的質(zhì)譜(MS)檢測(cè)器。Zheng等[23]利用LC/UV法檢測(cè)奧格列汀原料藥中的苯磺酸異丙酯,以220 nm作為測(cè)定波長(zhǎng),以添加0.1% (體積分?jǐn)?shù))乙酸的水/乙腈(65∶35, v/v)作為流動(dòng)相。該方法的檢出限和定量限分別為0.33 mg/L 和1 mg/L。由于磺酸酯具有遇水易分解的特性,因此在采用LC法進(jìn)行磺酸酯測(cè)定時(shí),需要特別關(guān)注磺酸酯的溶液穩(wěn)定性[24-26],否則可能導(dǎo)致假陰性的檢測(cè)結(jié)果。Kakadiya等[27]采用電噴霧電離(ESI)源,建立了LC/MS/MS法分別檢測(cè)洛匹那韋和利托那韋原料藥中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯,檢出限約為2 μg/L,回收率在80% ～120%之間。陳成等[28]則采用了大氣壓化學(xué)電離(APCI)源檢測(cè)2-脫氧-D-核糖中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯,該方法的檢出限為4 μg/L,回收率為91.7% ～113.1% 。Guo等[29]進(jìn)一步對(duì)APCI和ESI這兩種電離源進(jìn)行了對(duì)比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用ESI時(shí),方法的靈敏度和重現(xiàn)性較差。相較而言,采用APCI電離方式的負(fù)離子模式,各待檢磺酸酯的靈敏度較高,因此作者最終選用APCI方式用于甲磺酸伊馬替尼和長(zhǎng)春西汀原料藥中磺酸酯的檢測(cè),方法靈敏度在2 μg/L 左右,回收率在93% ～118%之間。針對(duì)復(fù)雜藥物基質(zhì),采用液液萃取等樣品前處理方式可以減少輔料等帶來的干擾。Cappiello等[30]在檢測(cè)對(duì)乙酰氨基酚片中的對(duì)甲苯磺酸甲酯等烷基化試劑時(shí),采用四氫呋喃作為萃取溶劑,然后采用電子轟擊(EI)電離源的LC/MS法進(jìn)行檢測(cè),回收率在55% ～82%之間,可以看出該方法的準(zhǔn)確性波動(dòng)較大。

表 5 文獻(xiàn)報(bào)道的磺酸酯檢測(cè)方法的檢出限及回收率匯總

IBS: isopropyl benzenesulfonate; MBS: methyl benzenesulfonate; EBS: ethyl benzenesulfonate; BBS: butyl benzenesulfonate; MTS: methylp-toluenesulfonate; ETS: ethylp-toluenesulfonate; ITS: isopropyl p-toluenesulfonate; MMS: methyl methanesulfonate; EMS: ethyl methanesulfonate; PMS: propyl methanesulfonate; IMS: isopropyl methanesulfonate; PBS: propyl benzenesulfonate; PTS: propylp-toluenesulfonate; DMS: dimethyl sulfate; DES: diethyl sulfate; DPS: dipropyl sulfate; DIPS: diisopropyl sulfate; API: active phamaceutical ingredient; SM934: an artemisinin derivative.

由于磺酸酯屬于酯類結(jié)構(gòu),在含水的流動(dòng)相中可能會(huì)發(fā)生水解等問題而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此利用化學(xué)衍生化的方式將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的物質(zhì)是解決磺酸酯在線水解問題的一種較好的方式。An等[31]建立了衍生化LC/MS法檢測(cè)甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯、甲磺酸異丙酯、苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸異丙酯、對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸丙酯、對(duì)甲苯磺酸異丙酯、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丙酯和硫酸二異丙酯等多種烷基酯類基因毒性雜質(zhì),采用10%(體積分?jǐn)?shù))三甲胺水溶液作為乙酯、丙酯和異丙酯的衍生化試劑,10%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺水溶液作為甲酯的衍生化試劑,在50～60 ℃條件下孵育60 min,衍生為較穩(wěn)定的季銨鹽,采用HILIC(hydrophilic interaction chromatography)親水色譜柱進(jìn)行方法學(xué)的開發(fā)和驗(yàn)證。但是該衍生化方法所得到的衍生產(chǎn)物的色譜峰出現(xiàn)了較為明顯的拖尾現(xiàn)象,而且該方法對(duì)于不同待測(cè)物的準(zhǔn)確性有比較大的差異,表現(xiàn)為回收率跨度較大,如苯磺酸丙酯的回收率為85% ,而苯磺酸乙酯的回收率高達(dá)137% 。Zhou等[32]則利用N,N-二乙基二硫代氨基甲酸作為衍生化試劑,向待測(cè)甲磺酸甲酯和乙酯中引入生色基團(tuán)進(jìn)行柱前衍生,采用UV檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。但該衍生化時(shí)間較為冗長(zhǎng),需耗時(shí)60 min。

2.2.2氣相色譜法

為了避免在采用LC法檢測(cè)磺酸酯時(shí)出現(xiàn)遇水易分解現(xiàn)象,具有一定揮發(fā)性或者半揮發(fā)性的磺酸酯可以采用GC進(jìn)行檢測(cè),并采用氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)或者M(jìn)S檢測(cè)器。Li[33]和鄭飛等[34]均采用直接進(jìn)樣GC/FID法檢測(cè)原料藥中的甲磺酸甲酯、乙酯和異丙酯,進(jìn)樣量為5 μL,進(jìn)樣口溫度為120 ℃。該方法由于引入大量的非揮發(fā)性藥物基質(zhì),容易污染進(jìn)樣口,因此需要及時(shí)更換襯管。此外,該方法由于采用FID檢測(cè)器,靈敏度較低,僅能檢測(cè)40 μg/L 及以上的磺酸酯。Ramakrishna等[35]報(bào)道了采用直接進(jìn)樣GC/MS法來測(cè)定甲磺酸伊馬替尼中的甲磺酸甲酯和乙酯,以正己烷作為樣品溶劑,采用DB-1色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度設(shè)定為140 ℃,進(jìn)樣量為2 μL,分流比為200∶1,其檢出限和定量限分別為0.3和1.0 mg/L,在1～15 mg/L 范圍內(nèi)的回收率為98.1% ～99.6% 。Zhang等[36]也報(bào)道了直接進(jìn)樣GC/MS法來對(duì)甲磺酸伊馬替尼中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯進(jìn)行定量分析。與上述Ramakrishna等建立的方法不同,該方法采用水飽和的正己烷作為樣品溶劑,以HP-5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)為色譜柱,得到的靈敏度更高,檢出限為1 μg/L,定量限為5 μg/L,在10～1 000 μg/L 范圍內(nèi)的準(zhǔn)確度為97.2% ～99.8% 。該方法同時(shí)還提高了進(jìn)樣口溫度(200 ℃),分流比也減小到100∶1。通過對(duì)比上述Zhang等與Ramakrishna等的研究工作,提示了樣品溶劑、進(jìn)樣口溫度和分流比等條件的優(yōu)化對(duì)于提高磺酸酯檢測(cè)方法的靈敏度至關(guān)重要。

雖然直接進(jìn)樣操作簡(jiǎn)單,但由于會(huì)因此引入大量非揮發(fā)性基質(zhì)而導(dǎo)致色譜系統(tǒng)污染從而出現(xiàn)平行性異常等問題,研究人員嘗試了固相微萃取(SPME)、液液萃取(LLE)作為樣品前處理方式的GC/MS法來檢測(cè)藥物中的磺酸酯。Colón等[37]建立了直接浸入式SPME-GC/MS的方法對(duì)藥物中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯進(jìn)行限度檢查,采用弱極性的聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)為固定相的微萃取頭,以20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 4.7)作為樣品溶劑,在該pH條件下藥物基質(zhì)被離子化而增大了極性,不易被固定相萃取從而減小了基質(zhì)效應(yīng)。Wollein等[38]采用LLE的樣品前處理方式檢測(cè)藥物固體制劑中的甲磺酸甲酯、乙酯、丙酯以及苯磺酸甲酯和乙酯,測(cè)得檢出限和定量限分別小于5和20 μg/L。由于該方法采用非極性的正己烷作為萃取溶劑,因此不適用于極性較大的藥物中磺酸酯的測(cè)定。

盡管SPME、LLE能在一定程度上降低基質(zhì)效應(yīng),但操作繁瑣,耗時(shí)耗力而且磺酸酯在進(jìn)樣口和襯管中的熱降解問題并沒有得到解決,因此,研究人員進(jìn)一步采用頂空衍生化的方式,將反應(yīng)性的磺酸酯衍生為較為穩(wěn)定的、揮發(fā)性的物質(zhì)。Lee等[39]采用硫氰酸鈉作為衍生化試劑,以水為溶劑,建立了頂空GC/MS方法檢測(cè)一種甲磺酸鹽中的甲磺酸甲酯、乙酯和異丙酯。然而該衍生方法會(huì)產(chǎn)生異構(gòu)化的產(chǎn)物(烷基硫氰酸和烷基異硫氰酸),從而不利于進(jìn)行定量測(cè)定,而且該方法僅僅局限于水溶性藥物,不適用于水溶性較差的藥物中磺酸酯的檢測(cè)。Alzaga等[40]采用五氟苯硫酚作為衍生化試劑(其溶劑為水和二甲亞砜混合溶液),將磺酸酯衍生為五氟苯硫醚,采用頂空GC/MS檢測(cè)。在方法驗(yàn)證的過程中發(fā)現(xiàn),該方法的準(zhǔn)確性(尤其是對(duì)甲苯磺酸甲酯)會(huì)明顯受到基質(zhì)的影響,檢測(cè)樣品A中的對(duì)甲苯磺酸甲酯的回收率僅有40% ,而對(duì)甲苯磺酸乙酯和異丙酯的回收率均大于93% ;樣品B中所有酯的回收率則在85%和100%之間。歐洲藥典(EP)[41]也描述了一種在線衍生化頂空GC/MS法檢測(cè)甲磺酸倍他司汀、苯磺酸氨氯地平和對(duì)甲苯磺酸舒他西林原料藥中的痕量甲磺酸酯、苯磺酸酯和對(duì)甲苯磺酸酯。采用碘化鈉(NaI)作為衍生化試劑,利用碘離子的親核性,將磺酸酯在線衍生為不同種類的碘代烷烴,經(jīng)GC/MS進(jìn)行分析檢測(cè)。該方法因衍生化反應(yīng)操作簡(jiǎn)便,具有較好的通適性而受到分析人員的青睞。范達(dá)等[42]采用了該衍生化方法檢測(cè)注射用甲磺酸吉米沙星中的甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯,以電子捕獲檢測(cè)器(ECD)代替了MS檢測(cè)器。發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)于不同磺酸酯的檢測(cè)靈敏度差異較大,其中甲磺酸甲酯的靈敏度最高,檢出限為0.002 μg/L,甲磺酸異丙酯的靈敏度最低,檢出限為0.25 μg/L。Liu等[43]發(fā)現(xiàn)EP采用的用于防止NaI氧化的抗氧劑硫代硫酸鈉對(duì)方法的耐用性具有不利影響,在延長(zhǎng)頂空平衡時(shí)間和升高平衡溫度時(shí)會(huì)造成對(duì)甲苯磺酸甲酯的衍生產(chǎn)物碘甲烷(MeI)的降解。研究發(fā)現(xiàn)選用維生素C作為替代抗氧劑,能夠在較高的平衡溫度和較長(zhǎng)的平衡時(shí)間下保持包括MeI在內(nèi)的衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性,并提高了該方法的耐用性并擴(kuò)展了相應(yīng)的應(yīng)用范圍,檢測(cè)限和定量限可以分別達(dá)到0.6和2 μg/L。

3 總結(jié)與展望

近年來有關(guān)藥物中的基因毒性雜質(zhì)的控制得到來自于藥物監(jiān)管部門與藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)的高度重視,基于風(fēng)險(xiǎn)管理的“階段化TTC”控制策略,使得基因毒性雜質(zhì)的控制更趨科學(xué)合理?；撬狨プ鳛橐活愝^為常見的基因毒性雜質(zhì),可以通過對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化與設(shè)計(jì)進(jìn)行有效控制,符合當(dāng)下“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的理念,即良好的工藝設(shè)計(jì)往往能促進(jìn)高質(zhì)量藥物的生產(chǎn),并在充分保障藥物安全性的基礎(chǔ)上盡可能減少企業(yè)的研發(fā)投入及相應(yīng)的政府監(jiān)管成本。

由于基因毒性雜質(zhì)在藥物中的控制較為嚴(yán)格,通常在μg/L甚至接近ng/L水平,因此需要建立高靈敏度的定量檢測(cè)方法,其中需要綜合考慮藥物基質(zhì)以及待測(cè)磺酸酯的揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性以及化學(xué)反應(yīng)特性等,有的放矢地建立滿足靈敏度需求的檢測(cè)方法。