5-氮雜-2′-脫氧胞苷對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)和細(xì)胞周期的影響?

田小莉 楊 潔 楊 靜 閆少春 時(shí)靜華# 邵 國(guó)

(1 包頭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室生物醫(yī)學(xué)研究中心， 神經(jīng)科學(xué)研究所， 包頭 014010； 2 內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 包頭 014010； 3 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100053)

表觀遺傳如DNA甲基化在哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的作用。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)是調(diào)控表觀遺傳DNA甲基化基因表達(dá)的關(guān)鍵酶，它催化甲基使其從S-腺苷-甲硫氨酸共價(jià)轉(zhuǎn)移到CpG島胞嘧啶殘基上[1]。哺乳動(dòng)物體中，有3類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，在基因組甲基化過程中起著不同的作用。DNMT1是維持基因組中甲基化狀態(tài)所必需的。DNMT3A和DNMT3B負(fù)責(zé)在胚胎發(fā)育期間或有絲分裂后的神經(jīng)元中將非甲基化的DNA甲基化[2-3]。5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)是DNMTs抑制劑，是一種胞嘧啶類似物，其通過與酶的半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合阻斷DNMTs功能[4]。很多癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR的修飾可以作為一種有效的藥物來(lái)干擾癌癥發(fā)展[5-7]。Xiong等[8]報(bào)道，5-Aza-CdR 通過改變表觀遺傳狀態(tài)誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞死亡。本研究主要是觀察5-Aza-CdR 對(duì)HT22細(xì)胞周期、凋亡及DNMTs表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HT22細(xì)胞系是小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，來(lái)自于HT4。本文所用細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院癌癥研究所和腫瘤分子生物學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室提供。HT22細(xì)胞中加入含有胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich，USA)，置于37℃、5% CO2潮濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9]，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%且細(xì)胞狀態(tài)良好，傳代并開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 5-Aza-CdR濃度篩選

為確定5-Aza-CdR的有效濃度，在HT22細(xì)胞中加入5、10、15、20mol/L和40μmol/L不同濃度的5-Aza-CdR，使用IncuCyte FLR在顯微鏡(4×)下對(duì)每孔細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，觀測(cè)細(xì)胞的增殖。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，20μmol/L 濃度的5-Aza-CdR對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用最大，5μmol/L濃度的5-Aza-CdR對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用最小。因此，我們選擇將HT22細(xì)胞在5μmol/L(最低)和20μmol/L(最高)濃度的5-Aza-CdR中孵育24h。對(duì)照組細(xì)胞中加入PBS孵育24h。

1.3 IncuCyte成像分析

96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每孔加入100μl含有10% FBS的DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基，每孔接種4×103個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)24h后加入不同濃度的5-Aza-CdR，加藥后實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞68h。使用IncuCyte Confluence 1.5版軟件(ESSEN Bioscience， Ann Arbor， MI， USA)分析數(shù)據(jù)。IncuCyte實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Real-time PCR分析

使用TRIzol試劑從HT22細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(cDNA Synthesis Kit(Invitrogen Company, USA))說(shuō)明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在ABI 7900PCR儀上進(jìn)行Real-time PCR，使用2△△CT方法，以β-actin做為內(nèi)參[10]。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次。表1是由Sangon生物技術(shù)公司(中國(guó)上海)合成的Real-time PCR引物。

1.5 免疫印跡檢測(cè)

使用(RIPA)細(xì)胞裂解液(碧云天，中國(guó)上海)提取蛋白，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce Biotechnology， Rockford， USA)測(cè)定蛋白濃度，然后用5%的SDS-PAGE濃縮膠和10% SDS-PAGE分離膠電泳分離等量的蛋白樣品，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，鼠源DNMT1、DNMT3A、DNMT3B多克隆抗體(Novus Biologicals， Littleton， CO， USA)、鼠源β-actin 單克隆抗體4℃孵育14h(Sigma， St.Louis， MO， USA)，洗膜3次，孵育山羊抗鼠二抗(1∶1000)，室溫2h。加ECL(碧云天，中國(guó)上海)發(fā)光液，放入蛋白凝膠圖像分析系統(tǒng)中掃描，使用Image J(Scion Corporation， Torrance， CA， USA)圖像分析系統(tǒng)來(lái)量化目的條帶的光密度。蛋白印跡數(shù)據(jù)以β-actin做內(nèi)參。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

HT22細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化20～30s后，將細(xì)胞收集于離心管中，1500r/min 4℃離心8min，預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過夜[11]。棄掉固定液，PBS沖洗細(xì)胞，加入適量PI(碘化丙啶)染色，避光4℃反應(yīng)30min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)G1期、S期細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

如上方法收集細(xì)胞懸液，加入400μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)進(jìn)行染色，輕輕混勻，避光4℃反應(yīng)30min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 DNMTs活性測(cè)定

收集的HT22細(xì)胞，1500r/min離心5min，棄去上清液。將收集的HT22細(xì)胞用EpiQuik核提取試劑盒(Epigentek， Brooklyn， NY， USA)提取核蛋白，用EpiQuik DNMT活性/抑制測(cè)定Ultra試劑盒(Epigentek Brooklyn， NY， USA)檢測(cè)總DNMTs，DNMT1和DNMT3A的活性，對(duì)樣品進(jìn)行DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR對(duì)HT22細(xì)胞形態(tài)的影響

不同濃度5-Aza-CdR對(duì)HT22細(xì)胞形態(tài)的影響如圖2所示。光學(xué)顯微鏡下觀察HT22細(xì)胞顯示，對(duì)照組(圖1A)中HT22細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞大且亮，折射率好，細(xì)胞膜邊界清晰。與對(duì)照組相比，5-Aza-CdR處理組中HT22細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞膜邊界粗糙且附著顆粒，出現(xiàn)胞質(zhì)空泡化(圖1B、C)。

2.2 5-Aza-CdR對(duì)HT22細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果表明，加入不同濃度5-Aza-CdR的HT22細(xì)胞，HT22細(xì)胞在S期的數(shù)目顯著增加，但在G1期細(xì)胞數(shù)目減少(圖2A)，表明細(xì)胞在S期阻滯。此外，5-Aza-CdR抑制早期凋亡，但促進(jìn)晚期凋亡(圖2B、C)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下HT22細(xì)胞形態(tài)，×40。A: 對(duì)照組；B: 5μmol/L 5-Aza-CdR加藥組；C: 20μmol/L 5-Aza-CdR加藥組；箭頭: 細(xì)胞質(zhì)空泡.

圖2 5-Aza-CdR對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。A: 細(xì)胞周期;a: S期;b: G1期。B: 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖;a: 對(duì)照組;b: 5μmol/L 5-Aza-CdR group; c: 20μmol/L 5-Aza-CdR group。C: 細(xì)胞凋亡;a: 早期凋亡;b: 晚期凋亡。*P<0.05.

Fig 1 Light microscopic examination of morphology of HT22 cells，×40. A： Control group; B： 5μmol/L 5-Aza-CdR group ; C： 20μmol/L 5-Aza-CdR group. Arrows depicted vacuolization.

Fig 2 Effects of 5-Aza-CdR on cell cycle progression. A: Cell cycle; a: S phase; b: G1 phase. B: Flow cytometric analysis results; a: Control group; b: 5μmol/L 5-Aza-CdR group; c: 20μmol/L 5-Aza-CdR group. C: Apoptosis; a: Early apoptosis; b: Late apoptosis.*P<0.05.

2.3 5-Aza-CdR對(duì)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DNMT1和DNMT3A mRNA表達(dá)水平顯著降低，但DNMT3B mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(圖3A)。DNMT1和3A蛋白表達(dá)水平顯著降低，與mRNA表達(dá)水平相一致(圖3B)，表明5-Aza-CdR對(duì)DNMT1和DNMT3A 的mRNA和蛋白表達(dá)起抑制作用。

2.4 DNMTs活性檢測(cè)

結(jié)果顯示，在2種5-Aza-CdR濃度下，DNMT1和DNMT3B活性顯著降低(圖4)，然而，總DNMTs活性未發(fā)生明顯變化。

圖3 5-Aza-CdR對(duì)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)水平的影響

圖4 5-Aza-CdR調(diào)節(jié)DNMTs活性的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康和生命且發(fā)病率僅次于心血管疾病的重大疾病，受到人們廣泛關(guān)注。研究顯示，癌癥的發(fā)生發(fā)展與基因組異常甲基化有關(guān)，如在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)整個(gè)基因組低甲基化，使原癌基因活躍、基因組易變等，致使原癌基因過度表達(dá)及染色體穩(wěn)定性降低，從而導(dǎo)致肺癌發(fā)生；某些基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生高甲基化[12-13]，使抑癌基因、凋亡基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因等轉(zhuǎn)錄受到抑制，表達(dá)減少或沉默，相應(yīng)的功能減弱或喪失，從而引起癌癥發(fā)生。

DNA甲基化是一種調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制，且甲基化和去甲基化有一定的可逆性。5-Aza-CdR作為一種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，曾被報(bào)道其影響細(xì)胞增殖、周期及凋亡，如Chen等[14]報(bào)道了5-Aza-CdR處理人食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)TE-1細(xì)胞系，顯示KLF4因子上調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯在S期；Fang等[15]指出，2μmol/L的5-Aza-CdR處理Daudi細(xì)胞系24h后，細(xì)胞在S期被阻滯；本研究用5μmol/L或20μmol/L 5-Aza-CdR處理HT22細(xì)胞24h后，顯示HT22細(xì)胞在S期阻滯，說(shuō)明5-Aza-CdR可以阻滯細(xì)胞周期，使細(xì)胞不再繼續(xù)分裂增殖。Christman[16]提出，5-Aza-CdR并入DNA骨架，導(dǎo)致DNMTs喪失活性；Pan等[17]報(bào)道了在胰腺癌細(xì)胞系(PANC-1)中，5-Aza-CdR 聯(lián)合大黃素通過減少DNMT1和DNMT3A的表達(dá)，來(lái)增強(qiáng)抑癌基因p16、RASSF1A和ppENK 5-Aza-CdR 的去甲基化；Zhang等[18]報(bào)道，10μmol/L的 5-AzaCdR對(duì)NG108-15膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤雜交細(xì)胞系產(chǎn)生完全細(xì)胞增殖停滯且降低DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達(dá)；本研究結(jié)果表明5-Aza-CdR處理降低DNMT1和DNMT3A的表達(dá)以及DNMT1和DNMT3B活性，說(shuō)明5-Aza-CdR可以有效降低DNMTs的表達(dá)及活性。

5-Aza-CdR可抑制細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性及其表達(dá)，影響細(xì)胞周期及凋亡，可以為癌癥治療提供一種有效途徑，且隨著研究的不斷深入，DNA甲基化與癌癥之間關(guān)系的研究將為癌癥早期診斷、評(píng)估癌癥風(fēng)險(xiǎn)、制定治療方案以及預(yù)后判斷等方面提供新的啟示。