藥物淋巴細(xì)胞刺激試驗診斷抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)的臨床價值研究

吳于青，代亮，陳雪花，廖永美

中國最新潛伏感染調(diào)查顯示，至少有2億～3億人感染了結(jié)核分枝桿菌，我國現(xiàn)有500萬肺結(jié)核患者，按照5%～15%的結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險進(jìn)行估算，我國將可能產(chǎn)生4 000萬新的活動性結(jié)核病患者［1］。終止結(jié)核病流行，及時診斷治愈每一例結(jié)核病患者尤為重要。

超敏反應(yīng)是結(jié)核病患者在治療過程中常見的不良反應(yīng)之一，約占抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)的15%［2］；按Gell-Coombs分類方法，超敏反應(yīng)分為速發(fā)型（Ⅰ型）、細(xì)胞毒型（Ⅱ型）、免疫復(fù)合物型（Ⅲ型）、遲發(fā)型（Ⅳ型）超敏反應(yīng)，而抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)主要表現(xiàn)為遲發(fā)型（Ⅳ型）超敏反應(yīng)［3］。藥物斑貼試驗因靈敏度、特異度均較低臨床已較少采用，目前臨床診斷抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)主要依靠藥物激發(fā)試驗（DPT），然而由于抗結(jié)核藥物常是聯(lián)合應(yīng)用，其可再次引發(fā)超敏反應(yīng)甚至剝脫性皮炎，不僅延長患者的住院時間，同時增加患者的痛苦，一定程度上打擊其治療疾病的信心，極不利于我國結(jié)核病的防控。因此，如何快速、安全、準(zhǔn)確地找出致敏藥物是臨床醫(yī)師亟需解決的難題。本研究旨在探究藥物淋巴細(xì)胞刺激試驗（DLST）診斷抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)的靈敏度、特異度，為今后全面開展抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)的體外檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合2013年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會《肺結(jié)核診斷和治療指南》［4］中初治肺結(jié)核的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）臨床表現(xiàn)及實驗室檢查符合2010年《臨床皮膚病學(xué)》［5］中藥物所致超敏反應(yīng)的診斷，并由2名專科醫(yī)師共同診斷為藥物所致超敏反應(yīng)。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）合并HIV感染者；（2）合并慢性腎臟病、糖尿病、造血系統(tǒng)疾病及自身免疫性相關(guān)疾病者；（3）接受抗結(jié)核治療的同時在服用其他疾病治療藥物。

1.1.3 剔除標(biāo)準(zhǔn) 已納入患者符合下列選項之一者予以剔除：（1）誤診、誤納；（2）抗過敏治療過程中使用了免疫抑制劑。

1.2 一般資料 選取2015年1月—2016年12月在江西省胸科醫(yī)院住院的初治肺結(jié)核治療過程中發(fā)生超敏反應(yīng)的患者60例，年齡21～62歲，平均年齡（40.8±7.0）歲。同期選取本院初治肺結(jié)核治療過程中未發(fā)生超敏反應(yīng)的患者60例作為對照組，年齡19～65歲，平均年齡（41.0±7.3）歲。兩組患者性別（χ2=0.917）、年齡（t=1.532）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)江西省胸科醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.3 方法

1.3.1 實驗藥物的制備 取患者已服用的可疑抗結(jié)核藥物〔異煙肼（INH）、乙胺丁醇（EMB）、利福平（RFP）、吡嗪酰胺（PZA）〕的單次劑量，用5 ml雙蒸水或二甲基亞砜（DMSO）劇烈震蕩溶解，再用0.22 μm濾器過濾除菌，予RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成3個濃度梯度（1∶10、1∶100、1∶1 000）。

1.3.2 外周血單核細(xì)胞（PBMC）分離 患者入組后在規(guī)定時間內(nèi)留取10 ml靜脈血備檢，采用密度梯度離心法從患者肝素抗凝的血標(biāo)本中分離PBMC，1×磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，重懸于2 ml RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清+青鏈霉素）并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。在96孔板每孔加入1×105/100 μl PBMC，再加入預(yù)先制備的刺激藥物5 μl。分別設(shè)置陰性對照孔（相同濃度的藥物溶解介質(zhì)+培養(yǎng)液+PBMC）、陽性對照孔〔植物血凝素（PHA）5 μg/ml+培養(yǎng)液+PBMC〕和調(diào)零孔（僅為培養(yǎng)液），每組設(shè)3個復(fù)孔。同時，每次實驗時均隨機(jī)取1例對照組患者的抗凝血標(biāo)本進(jìn)行相同的實驗。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.3.3 DLST 培養(yǎng)60 h后，向每孔加入10 μl Cell Counting Kit-8（CCK-8）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的光密度（OD），計算刺激指數(shù)（SI），SI=（刺激OD-調(diào)零孔OD）/（陰性對照孔OD-調(diào)零孔OD），SI≥1.80為陽性。對每種藥物分別進(jìn)行DLST，任意一種藥物檢測結(jié)果為陽性者，判定該患者為DLST陽性。如果陽性對照孔的SI＜1.80，或者3個復(fù)孔的偏差過大，則判定該藥物的DLST結(jié)果不可靠，需重新檢測。

1.3.4 導(dǎo)致超敏反應(yīng)藥物的判定 患者停藥后超敏反應(yīng)癥狀緩解并確定DLST結(jié)果后，進(jìn)行DPT（臨床判斷何種藥物所致超敏反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)［6］），每種藥物間隔時間3～4 d，試藥期間一旦出現(xiàn)DPT陽性［6］，即可確定為該藥物的超敏反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x ±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPT陽性和DPT陰性患者4種抗結(jié)核藥物的SI比較 DPT陽性患者INH、EMB、RFP和PZA的SI均高于DPT陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 DPT陽性和DPT陰性患者4種抗結(jié)核藥物的SI比較（x±s）Table 1 Comparison of the SI of the four anti-tuberculosis drugs in DPT-positive and DPT-negative patients

2.2 DLST對抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)的診斷價值DPT共檢出66例次抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)（其中4例次為EMB和RFP所致超敏反應(yīng)，2例次為INH和EMB所致超敏反應(yīng)）。DLST共檢出4例次兩種抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)（3例次為EMB和RFP所致超敏反應(yīng)，1例次為INH和EMB所致超敏反應(yīng)）。

DLST診斷INH、EMB、RFP、PZA所致超敏反應(yīng)的靈敏度分別為52.38%、50.00%、43.48%、58.33%，特異度分別為97.98%、99.09%、97.94%、100.00%（見表 2～5）。

表2 DLST對INH所致超敏反應(yīng)的診斷價值（例）Table 2 Diagnostic value of the DLST for INH-induced hypersensitivity

表3 DLST對EMB所致超敏反應(yīng)的診斷價值（例）Table 3 Diagnostic value of the DLST for EMB-induced hypersensitivity

表4 DLST對RFP所致超敏反應(yīng)的診斷價值（例）Table 4 Diagnostic value of the DLST for RFP-induced hypersensitivity

表5 DLST對PZA所致超敏反應(yīng)的診斷價值（例）Table 5 Diagnostic value of the DLST for PZA-induced hypersensitivity

3 討論

抗結(jié)核治療過程中的藥物不良反應(yīng)是影響患者治療進(jìn)程和效果的關(guān)鍵因素。我國抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率平均為15%，表現(xiàn)為肝功能異常、超敏反應(yīng)、關(guān)節(jié)痛等［7-9］；其中超敏反應(yīng)是抗結(jié)核治療中最常見的不良反應(yīng)之一。

目前臨床上對于超敏反應(yīng)的處理方法是暫時中斷用藥，待患者超敏反應(yīng)消失后采取DPT找出導(dǎo)致超敏反應(yīng)的抗結(jié)核藥物，這樣不僅延長患者的住院時間，同時加重患者的痛苦，打擊患者治療疾病的信心，甚至導(dǎo)致患者放棄治療，極不利于我國結(jié)核病的防控。因此，尋求一種能快速、準(zhǔn)確、安全地找出導(dǎo)致超敏反應(yīng)的抗結(jié)核藥物的檢測方法，是結(jié)核病臨床工作人員共同的努力方向。

遲發(fā)型（Ⅳ型）超敏反應(yīng)通常是在攝入抗結(jié)核藥物后數(shù)小時、數(shù)天甚至數(shù)周后發(fā)生，主要是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致，由多種細(xì)胞因子參與。T淋巴細(xì)胞的活化在藥物刺激后幾分鐘內(nèi)開始，引發(fā)鈣離子內(nèi)流和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加。幾小時后，細(xì)胞因子如白介素（IL）-2、IL-3、IL-4、干擾素（IFN）-γ、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β和早期細(xì)胞活化標(biāo)志受體如CD40L、CD69、CD25、CD71大量表達(dá)。T淋巴細(xì)胞活化后3～5 d，細(xì)胞進(jìn)入功能分化期，分化為不同類型的T淋巴細(xì)胞（Th1、Th2、Th17）和產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞因子（Th1、Th2、Th17型細(xì)胞因子），后者繼而又進(jìn)一步影響T淋巴細(xì)胞功能。體外實驗就是基于以上活化過程，從膜表面標(biāo)志受體表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞因子產(chǎn)生增加、T淋巴細(xì)胞增殖到細(xì)胞毒性檢測等，在不同階段檢測不同活化指標(biāo)［10-14］。

本研究采用CCK-8溶液檢測可疑藥物刺激后T淋巴細(xì)胞增殖，取代既往研究者采用的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法［15］，操作簡便、對實驗室要求低、結(jié)果變異率小，且為水溶性，實驗過程中不需要換液，尤其適合于懸浮細(xì)胞，且檢測的OD與活細(xì)胞數(shù)線性相關(guān)［15］，目前該技術(shù)已成熟，且已設(shè)立明確的陽性標(biāo)準(zhǔn)。

本研究對DLST檢測4種一線抗結(jié)核藥物（INH、EMB、RFP、PZA）所致超敏反應(yīng)的診斷價值進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DLST在診斷何種抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)中具有一定意義，主要表現(xiàn)為高特異度（均在97.00%以上），且靈敏度較3H-TdR滲入法高［16］，但總體來說靈敏度還是偏低（＜60.00%），考慮可能原因為：（1）藥物所致超敏反應(yīng)的病理機(jī)制是復(fù)雜的，T淋巴細(xì)胞免疫并不能完全涵蓋各種藥物所致超敏反應(yīng)的原因；（2）本研究入組患者入院后在皮疹發(fā)生后的短時間內(nèi)即留取靜脈血，考慮存在藥物洗脫期的影響。今后將在患者發(fā)生超敏反應(yīng)后的不同時期內(nèi)聯(lián)合多種體外檢測方法進(jìn)行檢測，預(yù)計將提高靈敏度。

綜上所述，DLST在診斷患者因何種抗結(jié)核藥物所致超敏反應(yīng)時具有較高的特異度，雖然靈敏度稍低，但對指導(dǎo)臨床用藥仍意義重大。