姜黃素通過Wnt2/β-catenin通路逆轉(zhuǎn)食管癌Eca-109/VCR細(xì)胞多藥耐藥性研究

任海玉,孫劍經(jīng),李 多,牛樹榮,劉 華,羅 強(qiáng),張林西

(河北北方學(xué)院1. 研究生學(xué)院、2. 附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科、3. 生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000)

我國食管癌患者就醫(yī)時(shí)多處于疾病的中晚期，患者的總體5年生存率<20%[1]?；熓侵型砥谑彻馨┑闹饕行е委煷胧┲?。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在化療過程中，部分患者會(huì)對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性(multi-drug resistance,MDR)，MDR嚴(yán)重影響了臨床治療效果和患者預(yù)后[2]。因此，尋找安全有效的MDR逆轉(zhuǎn)藥物，并探討其作用機(jī)制具有重要的臨床意義。

姜黃素(curcumin,Cur)是一種植物多酚，主要來源于姜黃屬植物的根莖中，是中藥姜黃的主要活性成分。實(shí)驗(yàn)表明，Cur對(duì)肺癌、卵巢癌等多種腫瘤MDR具有逆轉(zhuǎn)作用[3-4]。但Cur逆轉(zhuǎn)MDR的作用機(jī)制仍不清楚。Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)，其中Wnt2尤其與消化道腫瘤密切相關(guān)，但Wnt2/β-catenin信號(hào)通路與食管癌MDR逆轉(zhuǎn)作用是否有關(guān)鮮有報(bào)道。本研究擬以耐長春新堿(vincristine,VCR)的食管癌Eca-109/VCR細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用qPCR、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)等方法，探討Cur對(duì)食管癌MDR的逆轉(zhuǎn)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人食管癌耐藥細(xì)胞株(Eca-109/VCR)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2試劑 Cur購自美國Cayman公司；VCR、RPMI 1640不完全培養(yǎng)液，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒購自美國BD公司；P-gp ELISA試劑盒購自武漢基因美科技有限公司；總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；CCK-8試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑、細(xì)胞裂解液，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人Wnt2、β-catenin、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloprotein 2，MMP-2 )、高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)的多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器 BB16HF二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Stat Fax-210全自動(dòng)酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀(美國Awareness公司)；FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀(美國 BD 公司)；ABI PRISM 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀(美國GE公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Eca-109/VCR細(xì)胞使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，并將細(xì)胞置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，每2～3 d傳代1次。培養(yǎng)液中加入2.0 mg·L-1VCR維持細(xì)胞耐藥性，實(shí)驗(yàn)前撤藥培養(yǎng)1周，并選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、Cur單藥組(Cur組)、VCR單藥組(VCR組)、Cur與VCR聯(lián)合用藥組(Cur+VCR組)。

1.2.2Cur對(duì)Eca-109/VCR的增殖抑制率檢測 取對(duì)數(shù)生長期的Eca-109/VCR細(xì)胞制成單細(xì)胞細(xì)胞懸液，并將濃度調(diào)整為1×108·L-1，接種于96孔板，每孔200 μL，貼壁培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為10、20、40、80、160 μmol·L-1的Cur，陰性對(duì)照組加入含0 μmol·L-1Cur的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組為不含細(xì)胞和藥物的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。向每孔加入20 μL CCK-8液后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，通過全自動(dòng)酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處的吸光度(A)值，各組分別取平均值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：抑制率=[1-(處理組A值-空白對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)]×100%。選取抑制率<10%的Cur最大濃度(20 μmol·L-1)作為逆轉(zhuǎn)劑量，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Cur對(duì)Eca-109/VCR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)檢測 將對(duì)數(shù)生長期的Eca-109/VCR細(xì)胞制備成濃度為5×107·L-1的細(xì)胞懸液，每孔200 μL，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，貼壁后棄掉舊培養(yǎng)液。陰性對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組為不含細(xì)胞和藥物的陰性培養(yǎng)液。VCR單藥組分別加入終濃度為1.0、2.0、4.0、8.0 mg·L-1的VCR，Cur + VCR組分別加入20 μmol·L-1Cur與1.0、2.0、4.0、8.0 mg·L-1的VCR，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞抑制率：抑制率/%=[1-(處理組A值-空白對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)]×100%。計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(reversal fold，RF)：RF=耐藥細(xì)胞IC50/逆轉(zhuǎn)細(xì)胞IC50。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長期的Eca-109/VCR細(xì)胞制成濃度為1×108·L-1的細(xì)胞懸液，并接種于4個(gè)50 mL的培養(yǎng)瓶中，使用不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后加藥，Cur組加入20 μmol·L-1Cur，VCR組加入2.0 mg·L-1VCR，Cur + VCR組加入20 μmol·L-1Cur與2.0 mg·L-1VCR。作用24 h后，消化離心，收集細(xì)胞，按照Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書的操作流程處理細(xì)胞，并在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡百分率。

1.2.5ELISA檢測P-gp蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長期的Eca-109/VCR細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整其濃度為1×108·L-1，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長后，分別用20 μmol·L-1Cur、2.0 mg·L-1VCR單獨(dú)或聯(lián)合作用24 h。24 h后收集細(xì)胞，用PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×109·L-1左右，反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并釋放出細(xì)胞內(nèi)成分。2 000～3 000 r·min-1離心20 min，收集上清。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定P-gp的含量。

1.2.6qPCR檢測Wnt2、β-catenin mRNA的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的Eca-109/VCR細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分別加入20 μmol·L-1Cur、2.0 mg·L-1VCR、20 μmol·L-1Cur聯(lián)合2.0 mg·L-1VCR，對(duì)照組加入不含任何藥物的培養(yǎng)液，作用24 h后，分別收集各組細(xì)胞，提取總RNA，重復(fù)3次，選取A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0的RNA標(biāo)本，按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以此cDNA為模板，采用SYBR GreenⅠ兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并檢測Wnt2、β-catenin mRNA的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照。Wnt2上游引物序列為5’-GCCGAGTGGACAGCAGAATG-3’，下游引物序列為5’-AAACAAAGGCAGATTCCCGACTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為127 bp；β-catenin上游引物序列為5’-GAATGTCTGAGGACAAGCCACAAG-3’，下游引物序列為5’-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為127 bp；β-actin上游引物序列為5’-TGGCACCCGCACAATGAA-3’，下游引物序列為5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為186 bp。采集、分析各組Wnt2、β-catenin mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以2-ΔΔCt值表示。設(shè)對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量為100%，分別計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組Wnt2、β-catenin mRNA的相對(duì)表達(dá)率。

1.2.7Western blot檢測Wnt2、β-catenin、MMP-2、HMGB1蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的Eca-109/VCR細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，貼壁培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組分別加入20 μmol·L-1Cur、2.0 mg·L-1VCR、20 μmol·L-1Cur聯(lián)合2.0 mg·L-1VCR。作用24 h后，提取各組Eca-109/VCR細(xì)胞總蛋白，各組取等量蛋白提取液，分別加入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂奶粉封閉1 h后，加入抗Wnt2、β-catenin、MMP-2、HMGB1(1 ∶500)一抗，4℃孵育過夜，洗膜后，加入相應(yīng)二抗(1 ∶10 000)室溫反應(yīng)2 h，再次洗膜，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，使用Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀檢測蛋白條帶，實(shí)驗(yàn)以β-actin校正作相對(duì)量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1Cur對(duì)Eca-109/VCR細(xì)胞增殖抑制率的影響如Fig 1所示，Cur(10、20、40、80、160 μmol·L-1)作用于Eca-109/VCR細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖抑制率隨著Cur的濃度增加而明顯升高，呈劑量依賴性，且當(dāng)Cur≤20 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率均小于10%，故選取對(duì)食管癌細(xì)胞株Eca-109/VCR抑制率<10%的最大姜黃素濃度，即20 μmol·L-1的Cur，作為逆轉(zhuǎn)劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2Cur、VCR單藥或聯(lián)合作用對(duì)Eca-109/VCR細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用如 Fig 2所示，不同濃度VCR單藥或與Cur(20 μmol·L-1)聯(lián)合作用24 h后，各Cur+VCR組對(duì)Eca-109/VCR細(xì)胞的增殖抑制率較相應(yīng)VCR組明顯升高(P<0.01)，說明20 μmol·L-1Cur能明顯增加不同濃度VCR對(duì)Eca-109/VCR的抑制作用，且濃度為20 μmol·L-1Cur與2.0 mg·L-1VCR聯(lián)合作用后，對(duì)細(xì)胞的抑制作用增加幅度最大，達(dá)40.39%。此外，VCR組與Cur+VCR組的IC50分別為5.13、1.47 mg·L-1，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.49。

Fig 1 The inhibitory rate of Eca-109/VCRcell line treated with curcumin for 24

*P<0.05vs0 μmol·L-1

Fig 2 The reversal effect of curcuminon Eca-109/VCR cell

**P<0.01vsthe same concentration of VCR

2.3Cur、VCR單藥或聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響如Fig 3所示，Cur(20 μmol·L-1)和VCR(2.0 mg·L-1)單藥或聯(lián)合作用24 h后，對(duì)照組、Cur組和VCR組的細(xì)胞凋亡率分別為(1.37±0.30) % 、(8.50±0.84)%、(9.87±0.89)%，而Cur+VCR組的細(xì)胞凋亡率為 (18.46 ± 2.38)%，可見聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率明顯高于兩單藥組及對(duì)照組(P<0.05)。

2.4Cur、VCR單藥或聯(lián)合作用對(duì)P-gp蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，Cur+VCR組的P-gp蛋白含量明顯低于VCR組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 3 The apoptosis rate of Eca-109/VCR cell line treatedby single Cur,VCR or their combination for 24

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsthe same concentration of VCR

Fig 4 Effects on protein expression of P-gp in Eca-109/VCRcells treated with Cur and VCR aloneor their combination for 24

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsthe same concentration of VCR

2.5Cur、VCR單藥或聯(lián)合作用對(duì)Wnt2、β-cateninmRNA表達(dá)的影響如Fig 5所示，與對(duì)照組相比，各用藥組Wnt2、β-catenin mRNA的表達(dá)均降低(P<0.05)，且Cur+VCR組Wnt2、β-catenin mRNA的表達(dá)均較VCR組明顯降低(P<0.05)。

Fig 5 The relative expression level of Wnt2 and β-cateninmRNA in Eca-109/VCR cells treated with Cur andVCR alone or their combination for 24

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsthe same concentration of VCR

2.6Cur、VCR單藥或聯(lián)合作用對(duì)Wnt2、β-catenin、MMP-2、HMGB1蛋白表達(dá)的影響如Fig 6所示，Cur(20 μmol·L-1)和VCR(2.0 mg·L-1)單藥或聯(lián)合作用24 h后，與對(duì)照組相比，除Cur組Wnt2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各用藥組Wnt2、β-catenin、MMP-2、HMGB1蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，且Cur+VCR組Wnt2、β-catenin、MMP-2、HMGB1蛋白的表達(dá)均較VCR單藥組明顯降低(P<0.01)。

3 討論

我國食管癌具有高發(fā)病率、高死亡率、預(yù)后較差等特點(diǎn)。在臨床食管癌化療過程中產(chǎn)生的多藥耐藥現(xiàn)象，嚴(yán)重地影響了中晚期食管癌患者的治療效果[5]。腫瘤多藥耐藥形成的機(jī)制比較復(fù)雜，包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥、酶系統(tǒng)介導(dǎo)的多藥耐藥、凋亡基因介導(dǎo)的多藥耐藥等。90%以上腫瘤患者的死亡原因都與不同程度的化療耐藥密切相關(guān)。因此，尋找高效、低毒副作用的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物，并探討其可能的逆轉(zhuǎn)機(jī)制已成為近年來的研究熱點(diǎn)。

Cur是姜黃中的一種天然、低毒、價(jià)廉的酚類色素，研究表明，其可通過不同途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cur對(duì)食管癌耐長春新堿Eca-109/VCR細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，其細(xì)胞增殖抑制率隨著Cur濃度增加而明顯升高，且小劑量Cur(20 μmol·L-1)與VCR(2.0 mg·L-1)聯(lián)合作用24 h后，對(duì)Eca-109/VCR細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.49。此外，Cur與VCR聯(lián)合作用24 h，P-gp蛋白的表達(dá)較VCR組明顯降低，細(xì)胞凋亡率較VCR組明顯升高。結(jié)果提示，小劑量Cur可能通過下調(diào)P-gp的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)Eca-109/VCR細(xì)胞的耐藥性，提高其對(duì)VCR的敏感性。

*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsthe same concentration of VCR

Wnt2基因是Wnt家族成員之一。Wnt信號(hào)通路與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及多藥耐藥性密切相關(guān)[8-11]。Wnt2 mRNA在人胎肺、胎腎及胎盤中均有表達(dá)，但在正常成人的胃腸道沒有表達(dá)。Wnt2通常激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，Wnt2存在時(shí)，與卷曲蛋白1(FZD1)結(jié)合后，使得由 Axin、GSK-3β、APC組成的分解復(fù)合體解聚，影響β-catenin的正常降解，導(dǎo)致其在胞質(zhì)中不斷積累，最終進(jìn)入胞核，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因分為間接靶基因與直接靶基因。后者因啟動(dòng)子區(qū)大多含有DNA順式作用元件5′-A/TA/TCAAAG-3′，可與β-catenin/TCF復(fù)合體結(jié)合并進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄，而MDR1就是一個(gè)直接靶基因。通過降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性后，可下調(diào)MDR1/P-gp的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥細(xì)胞的多藥耐藥性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，小劑量Cur與VCR聯(lián)合作用后，在基因水平及蛋白水平均可明顯下調(diào)Wnt2與β-catenin的表達(dá)，同時(shí)，P-gp的表達(dá)也明顯降低，提示小劑量Cur可以通過下調(diào)Wnt2與β-catenin基因及蛋白的表達(dá)，降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)Eca-109/VCR細(xì)胞的多藥耐藥性。

MMP-2是一種明膠酶，屬于金屬基質(zhì)蛋白酶家族，主要降解明膠及Ⅳ型膠原。研究表明[13]，MMP-2與食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。HMGB1是高遷移率族蛋白(high mobility group box chromosomal protein,HMG)家族的重要成員，參與調(diào)節(jié)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)等多種功能，可通過介導(dǎo)細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14-15]。目前，MMP-2、HMGB1基因表達(dá)與食管癌MDR是否相關(guān)少見報(bào)道。本研究中，小劑量Cur聯(lián)合VCR作用于Eca-109/VCR細(xì)胞24 h后，可明顯下調(diào)MMP-2、HMGB1蛋白表達(dá)水平。提示小劑量Cur增強(qiáng)Eca-109/VCR細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，逆轉(zhuǎn)MDR的作用，還可能與下調(diào)MMP-2、HMGB1有關(guān)。

綜上所述，Cur能夠逆轉(zhuǎn)Eca-109/VCR細(xì)胞的多藥耐藥性，其機(jī)制可能是通過下調(diào)Wnt2和β-catenin基因的表達(dá)，抑制Wnt2/β-catenin信號(hào)通路活性，以及降低MMP-2、HMGB1蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。Cur可能是一種能夠提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，并逆轉(zhuǎn)其耐藥性的較好的輔助化療藥物，有望解決化療過程中腫瘤細(xì)胞耐藥的難題。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心完成，感謝孫黎、蘭金蘋、張曉麗老師給予實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助！)