TNF—α啟動(dòng)子基因多態(tài)性與子癇前期的相關(guān)分析

劉影林　龍峰　周璐　何云　黃燕　洪小蘋

【摘要】 目的：研究腫瘤壞死因子α（TNF-α）啟動(dòng)子基因多態(tài)性與子癇前期的關(guān)系。方法：選取本院2014年9月-2017年9月期間收治的子癇前期患者156例作為研究組，另選取同期來(lái)本院產(chǎn)檢無(wú)并發(fā)癥的正常妊娠孕婦150例作為對(duì)照組，對(duì)兩組研究對(duì)象進(jìn)行TNF-α啟動(dòng)子基因檢測(cè)，分析TNF-α啟動(dòng)子基因多態(tài)性與子癇前期的關(guān)系。結(jié)果：重度子癇前期患者血清TNF-α表達(dá)水平為（3.96±0.78）pg/mL

明顯高于輕度子癇前期的（3.22±0.71）pg/mL；輕度子癇前期患者血清TNF-α表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組的（2.43±0.64）pg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。研究組TNF-α-238啟動(dòng)子基因型分布情況與對(duì)照組對(duì)比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P>0.05）；研究組TNF-α-308啟動(dòng)子GA和AA基因型分布率均明顯高于對(duì)照組，GG基因型分布率明顯低于照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。GG、GA+AA基因型在不同程度子癇前期患者中對(duì)比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。GA+AA基因型患者血清TNF-α表達(dá)水平為（4.31±0.46）pg/mL，明顯高于GG基因型的（3.25±0.63）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：TNF-α-308啟動(dòng)子基因多態(tài)性可影響細(xì)胞因子的表達(dá)水平，可能參與了子癇前期的發(fā)病過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】 TNF-α； 基因多態(tài)性； 子癇前期； 相關(guān)性

【Abstract】 Objective：To study the correlation of tumor necrosis factor α （TNF-α） promoter gene polymorphism and pre-eclampsia. Method：A total of 156 patients with pre-eclampsia treated from September 2014 to September 2017 in our hospital were selected as the study group. In addition，150 normal pregnant women without complications at the same period were selected as the control group.The TNF-α promoter gene was detected in two groups，and the relationship between TNF-α promoter polymorphism and pre-eclampsia was analyzed.

Result：The level of serum TNF-α expression in patients with severe pre-eclampsia was （3.96±0.78）pg/mL，which was significantly higher than （3.22±0.71）pg/mL in mild pre-eclampsia；the level of serum TNF-α expression in the patients with mild pre-eclampsia was significantly higher than （2.43±0.64）pg/mL in the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The TNF-α-238 promoter gene distribution rate in the study group was not significantly different from that in the control group （P>0.05）.The TNF-α-308 promoter GG and AA genotypes distribution rates in the study group were significantly higher than that in the control group；the GA genotype distribution rate was significantly lower than that in the control group，the differences were statistically significant （P<0.05）.There were no significant differences in GG，GA+AA genotype distribution rates in patients with different degree of pre-eclampsia（P>0.05）.The level of serum TNF-α expression in patients with GA+AA genotypes were （4.31±0.46）pg/mL，which was significantly higher than （3.25±0.63）pg/mL in patients with GG genotype，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The TNFα-308 promoter gene polymorphism will affect the level of cell factor expression and be involved into the genesis process of pre-eclampsia.

【Key words】 TNF-α； Gene polymorphism； Pre-eclampsia； Correlation

First-authors address：Shenzhen Maternity and Child Healthcare Hospital Affiliated to Southern Medical University，Shenzhen 518028，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.22.006

子癇前期（Pre-eclampsia，PE）是妊娠期特有的一種病癥，屬于妊娠期高血壓范疇，據(jù)報(bào)道PE的發(fā)病率為5%～10%，主要表現(xiàn)為妊娠期間一過(guò)性蛋白尿、高血壓、水腫等癥狀，妊娠終止后癥狀隨之消失，PE可引起嚴(yán)重的母胎并發(fā)癥，也是造成孕婦、圍產(chǎn)兒死亡的重要原因[1-3]。隨著近年來(lái)對(duì)子癇前期的不斷深入研究，雖然對(duì)子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但部分學(xué)者提出一些病因?qū)W說(shuō)，如胎盤缺血缺氧學(xué)說(shuō)、免疫學(xué)說(shuō)、遺傳學(xué)說(shuō)以及氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等，從不同角度試圖去解釋子癇前期的發(fā)病原理[4]。目前認(rèn)為子癇前期的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，但遺傳因素是子癇前期發(fā)病的主要因素[5]。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種炎性因子，目前認(rèn)為TNF-α啟動(dòng)子基因多態(tài)性及其編碼的蛋白表達(dá)水平與機(jī)體自身免疫遺傳疾病具有密切關(guān)系，參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展[6]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為TNF-α啟動(dòng)子基因與子癇前期的發(fā)生和發(fā)展具有密切關(guān)系[7]。該研究對(duì)本院子癇前期患者進(jìn)行研究，對(duì)比無(wú)并發(fā)癥正常孕婦，觀察TNF-α啟動(dòng)子基因多態(tài)性與子癇前期的關(guān)系，進(jìn)一步為臨床治療子癇前期提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2014年9月-2017年9月期間收治的子癇前期患者156例作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)檢查和診斷均符合子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；（2）均自愿參加本次研究并簽署知情同意書；（3）年齡20～40歲的育齡產(chǎn)婦；（4）均為初婚初孕的單胎產(chǎn)婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他妊娠疾病影響研究；（2）不愿參加研究；（3）有輸血史；（4）少數(shù)民族。另選取同期來(lái)本院產(chǎn)檢無(wú)并發(fā)癥的正常妊娠孕婦150例作為對(duì)照組。該研究已經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 研究中的血液樣本是在孕婦孕晩期（妊娠第28～40周）產(chǎn)檢時(shí)所采集，抽取研究對(duì)象外周血4 mL。其中2 mL注入干燥管，室溫下放置20 min后采用離心機(jī)旋轉(zhuǎn)離心（3 000 r/min），

10 min后取上層血清置入-80 ℃的冰箱中備用。剩余2 mL血液注入EDTA抗凝管，放置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 檢測(cè)方法 （1）TNF-α-238、TNF-α-308位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)：采用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法分析TNFα啟動(dòng)子基因多態(tài)性。TNF-α-238上游引物：5-CAAACACAGGCCTCAGGA-3；下游引物：5-GGGCGGGGAAAGAATCATTC-3；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度456 bp，限制性內(nèi)切酶為BamH I。TNFα-308上游引物：5-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3；下游引物：5-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度107 bp，限制性內(nèi)切酶為Ncol I。

（2）TNF-α血清表達(dá)水平檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)研究對(duì)象TNF-α血清表達(dá)水平，采用由北京博邁杰科技有限公司提供的試劑盒及相關(guān)試劑，嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察兩組血清TNF-α表達(dá)水平，分析不同程度子癇前期患者血清TNF-α表達(dá)水平情況。觀察兩組TNF-α啟動(dòng)子基因多態(tài)性情況，分析不同程度子癇前期患者TNF-α啟動(dòng)子基因多態(tài)性情況，探討TNF-α啟動(dòng)子基因多態(tài)性與子癇前期的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析計(jì)算相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基線資料對(duì)比 研究組年齡21～38歲，平均（28.4±4.2）歲；疾病程度：輕度子癇前期72例，重度子癇前期84例。對(duì)照組年齡20～38歲，平均（28.2±4.1）歲。兩組患者年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 不同程度子癇前期患者血清TNF-α表達(dá)水平對(duì)比 重度子癇前期患者血清TNF-α表達(dá)水平為（3.96±0.78）pg/mL，明顯高于輕度子癇前期的（3.22±0.71）pg/mL；輕度子癇前期患者血清TNF-α表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組的（2.43±0.64）pg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 兩組TNF-α啟動(dòng)子基因型分布情況對(duì)比 研究組TNF-α-238啟動(dòng)子基因型分布情況與對(duì)照組對(duì)比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P>0.05）；研究組TNF-α-308啟動(dòng)子GA和AA基因型分布率均明顯高于對(duì)照組，GG基因型分布率明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 不同程度子癇前期患者TNF-α-308基因型分布情況對(duì)比 GG、GA+AA基因型在不同程度子癇前期患者中對(duì)比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.5 不同基因型子癇前期患者血清TNF-α表達(dá)水平對(duì)比 GA+AA基因型患者血清TNF-α表達(dá)水平為（4.31±0.46）pg/mL，明顯高于GG基因型的（3.25±0.63）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

子癇前期是婦產(chǎn)科較為常見(jiàn)的疾病，發(fā)生于妊娠期的特殊疾病之一，個(gè)體的遺傳、免疫因素決定著疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。目前子癇前期具有家族遺傳傾向已經(jīng)得到臨床專家學(xué)者的認(rèn)可。隨著免疫學(xué)和遺傳學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步，目前對(duì)子癇前期疾病的探索已經(jīng)發(fā)展至基因?qū)哟?，為探討子癇前期遺傳、免疫學(xué)的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路和方案，通過(guò)對(duì)基因多態(tài)性和免疫學(xué)關(guān)系的研究，可使筆者從基因水平上認(rèn)識(shí)子癇前期的發(fā)病機(jī)制，為治療子癇前期提供新的依據(jù)[10-11]。人類TNF-α基因在第六號(hào)染色體的短臂上（6p21.3），人類白細(xì)胞抗原（HLA）Ⅲ區(qū)域內(nèi)，與HLA基因連鎖。在TNF-α啟動(dòng)子區(qū)域存在高度多態(tài)性，目前多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)TNF-α啟動(dòng)子-308位點(diǎn)基因多態(tài)性與多種免疫疾病有密切關(guān)系[12-13]。如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型肝炎、Gracess眼病、再生障礙性貧血等。研究還發(fā)現(xiàn)，TNF-α-308A是免疫性疾病的易感基因，而TNF-α-308G則是免疫性疾病的保護(hù)基因。

TNF-α-238、TNF-α-308位點(diǎn)存在3種基因型，包括GG、GA以及AA。該研究對(duì)本院子癇前期患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)子癇前期患者以及正常孕婦均存在3種基因型的表達(dá)。兩組研究對(duì)象TNF-α-238位點(diǎn)基因型分布頻率對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示TNF-α-238位點(diǎn)基因?qū)ψ影B前期的發(fā)生無(wú)明顯影響。研究組患者TNF-α-308GA和AA型的分布頻率均明顯高于正常對(duì)照組，而研究組TNF-α-308GG型的分布頻率明顯低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果表明TNF-α-308GA和AA陽(yáng)性者的子癇前期發(fā)病率明顯較高，而TNF-α-308GG陽(yáng)性者的子癇前期發(fā)病率明顯降低。提示TNF-α-308GA和AA可能是子癇前期的易感基因，而TNF-α-308GG可能是子癇前期的保護(hù)基因。上述研究結(jié)果提示TNF-α-308位點(diǎn)基因與子癇前期的發(fā)生發(fā)展具有一定關(guān)系，可能機(jī)制為：（1）TNF-α-308位點(diǎn)存在于人第六號(hào)染色體短臂上，在HLA Ⅲ類基因內(nèi)，TNF-α-308A與DRB1*0301存在連鎖不平衡[14-15]。（2）TNF-α自身基因多態(tài)性可能會(huì)影響細(xì)胞因子的表達(dá)，使TNF-α水平升高，增加滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生毒素，使內(nèi)皮細(xì)胞損傷，凝血因子釋放，引起子癇前期的發(fā)生[16]。在本文中還對(duì)不同程度的子癇前期患者進(jìn)行對(duì)比，分析不同程度子癇前期患者TNF-α-308基因型分布頻率情況，結(jié)果顯示，TNF-α-308GA+AA和TNF-α-308GG基因型分布頻率在輕度子癇前期和重度子癇前期患者中對(duì)比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示TNF-α-308GA+AA和TNF-α-308GG僅與子癇前期的發(fā)生有關(guān)，與子癇前期的發(fā)展并無(wú)關(guān)系。子癇前期是由于各種因素綜合作用的結(jié)果，除了遺傳因素最為重要以外，還包括免疫、血管內(nèi)皮損傷、營(yíng)養(yǎng)等因素[17]。遺傳因素在子癇前期的發(fā)展中起到根本性作用，但子癇前期病情的嚴(yán)重程度卻受到多種因素的影響，決定性因素尚未明確，需要進(jìn)一步深入研究[18]。

在個(gè)體中細(xì)胞因子的功能是由基因所決定的，而細(xì)胞因子在不同個(gè)體中的差異性是由細(xì)胞因子調(diào)節(jié)區(qū)多態(tài)性所決定[19]。在本文研究中，TNF-α-308位點(diǎn)基因（GA+AA）型的表達(dá)水平明顯高于GG型表達(dá)水平，可見(jiàn)TNFα-308位點(diǎn)基因編碼的細(xì)胞因子與TNF-α的血清表達(dá)水平有關(guān)。TNF-α-308多態(tài)性與血清學(xué)表達(dá)的機(jī)制尚未完全明確，但可能與下列原因有關(guān)：（1）TNF-α基因型與HLA Ⅲ區(qū)域位點(diǎn)連鎖，HLA多態(tài)性突變會(huì)影響TNF-α的分泌[20]。（2）TNF-α在轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，受到多態(tài)性的調(diào)控，從而改變DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合[21]。在本研究中，重度子癇前期患者TNF-α表達(dá)水平明顯高于輕度子癇前期的TNF-α水平，提示TNF-α表達(dá)水平與子癇前期的發(fā)展有密切關(guān)系?？赡苁怯捎赥NF-α是子癇前期發(fā)病過(guò)程中的重要因子，病情越嚴(yán)重，對(duì)免疫功能損傷越嚴(yán)重，伴有免疫反應(yīng)，導(dǎo)致TNF-α水平增加[22]。

綜上所述，TNF-α-308啟動(dòng)子基因多態(tài)性可影響細(xì)胞因子的表達(dá)水平，可能參與了子癇前期的發(fā)病過(guò)程。

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（收稿日期：2018-04-19） （本文編輯：李瑩瑩）