mTOR信號通路的激活在左旋多巴誘發(fā)異動癥中的作用及機制研究

柳學勇　陳小武

【摘要】 目的：探討mTOR信號通路的激活在左旋多巴誘發(fā)異動癥（L-dopa induced dyskinesia，LID）中的作用及可能機制。方法：60只普通雄性大鼠，其中選取10只作為健康對照組，皮下注射安慰劑葵花油2 mg/kg；其余50只采用魚藤酮2 mg/kg，頸背部注射，以大鼠行為變化2～6分選為PD組；PD組大鼠L-dopa 10 mg+Benserazide誘導，制備LID模型，最終大鼠模型對照組（n=10），PD組（n=10），LID組（n=14）。Western Blot技術檢測大鼠紋狀體S6K的Thr389、S6Ser240/244表達及mTOR的蛋白活性（p70S6K）及免疫組織化學檢測AMPA受體亞基GluR1、GluR2水平。結果：LID組大鼠Thr389、S6Ser240/244、代表mTOR蛋白活性p70S6K表達及GluR1、GluR2陽性細胞數(shù)均明顯高于PD組及對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；PD組大鼠Thr389、S6Ser240/244、代表mTOR蛋白活性p70S6K表達及GluR1、GluR2陽性細胞數(shù)均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：mTOR信號通路激活參與了PD及LID的發(fā)病，mTOR信號通路激活Thr389位點，進而激活S6K，引發(fā)S6Ser240/244激活，導致PD、LID的發(fā)生及進展。而且mTOR激活后，AMPA受體亞基GluR1、GluR2功能增強，對LID的發(fā)生也具有促進作用。

【關鍵詞】 mTOR； 帕金森； 左旋多巴； 異動癥； S6K； AMPA

【Abstract】 Objective：To explore the role and possible mechanism of activation of mTOR signaling pathway in Levodopa induced dyskinesia. Method：A total of 60 normal male rats，10 of them were selected as healthy control group and subcutaneously injected with placebo sunflower oil for 2 mg/kg.The other 50 rats were injected rotenone 2 mg/kg and neck back injection，and PD group was selected for 2-6 points of rat behavior change. PD group rats were induced by L-dopa 10 mg+Benserazide，and LID model was prepared.Finally，rat model control group （n=10），PD group （n=10），LID group.The Thr389 and S6Ser240/244 expression of S6K in the striatum and the protein activity of mTOR （p70S6K） were detected by Western Blot technique，the level of AMPA receptor subunit GluR1 and GluR2 were detected by immunohistochemistry.Result：The expression of Thr389， S6Ser240/244，P70S6K representing the activity of mTOR protein and the positive cells numbers of GluR1 and GluR2 in LID group were significantly higher than those in PD and control group，the differences were statistically significant （P<0.05）.The expression of Thr389， S6Ser240/244，P70S6K representing the activity of mTOR protein and the positive cells numbers of GluR1 and GluR2 in PD group were significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant （P<0.05）.Conclusion：The activation of mTOR signaling pathway is involved in the pathogenesis of PD and LID.The mTOR signaling pathway activates the Thr389 site，then activates S6K，triggering the activation of S6Ser240/244，leading to the occurrence and development of PD and LID.After mTOR activation，the function of AMPA receptor subunit GluR1 and GluR2 were increased，which also promoted the occurrence of LID.

【Key words】 mTOR； Parkinson； Levodopa； Dyskinesia； S6K； AMPA

First-authors address：University of Chinese Academy of Sciences Shenzhen Hospital，Shenzhen 518106，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.22.002

帕金森病（Parkinsons disease，PD）為神經(jīng)科臨床常見病，其以中腦多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡為主要的病理改變。隨后紋狀體多巴胺含量顯著性減少，從而致病出現(xiàn)臨床癥狀。但目前，導致此病理改變的確切病因仍不甚清楚。目前的研究提示，年齡老化、遺傳因素、氧化應激、環(huán)境等因素均可能參與此病例變化過程，可能為多因素的機制。左旋多巴（L-dopa）是臨床治療PD的主要藥物之一，然而有文獻報道顯示L-dopa在治療PD患者5年后，超過50%療效減退，且引發(fā)了運動并發(fā)癥—異動癥（L-dopa induced dyskinesia，LID），此并發(fā)癥難以控制[1]。LID一旦出現(xiàn)將長期存在，臨床處理非常困難[2]，后續(xù)治療費用十分高昂。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要通過下游兩個效應分子真核細胞翻譯啟始因子4E結合蛋白1（4E-BP1）和p70核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）控制mRNA的起始翻譯，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成。蛋白質(zhì)的合成是一個受到高度調(diào)節(jié)的過程，目前所知的大多數(shù)翻譯調(diào)節(jié)機制發(fā)生在蛋白質(zhì)的起始翻譯階段。而mTOR是蛋白質(zhì)的起始翻譯階段最主要的調(diào)節(jié)信號分子。大量研究資料表明，mTOR調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的合成在突觸可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR不僅在NMDA受體依賴的LTP起重要作用，同時在mGluR依賴的LTD（long-term depression）中發(fā)揮作用[3]，研究還發(fā)現(xiàn)mTOR、eIF4E（真核細胞翻譯啟始因子4E）以及4E-BP與突觸后標志物共存，強烈提示了依賴于mTOR翻譯機制的突觸可塑性調(diào)節(jié)[4]。目前mTOR的激活是如何導致皮質(zhì)紋狀體突觸的“病理性”尚未明確。本研究以大鼠模型研究左旋多巴誘發(fā)異動癥與mTOR信號通路的激活的關系，從而探討其作用及可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 材料：健康雄性大鼠60只，體質(zhì)量200～300 g（廣州醫(yī)學院）。試劑：葵花油、魚藤酮均購于達安基因公司。阿撲嗎啡、L-dopa、Benserazide均購于美國sigma公司。RIPA裂解液（碧云天公司，中國）、LC3多克隆抗體（Abcam，英國）。p70S6K多克隆抗體（Protein tech，美國）、Thr389（Protein tech，美國）、S6Ser240/244（Protein tech，美國）、GAPDH多克隆抗體（華安生物，杭州）、ECL增強型化學發(fā)光試劑盒、PVDF膜（Millipore，美國）。儀器：腦立體定位儀（日本Narishige公司），EG1150H型組織包埋機（德國Leica公司），TS-1脫色搖床（上海禾穎儀器表制造研究所）。

1.2 模型制作 所有健康雄性大鼠均由專業(yè)動物飼養(yǎng)員喂養(yǎng)，溫度控制在20～25 ℃，濕度控制在55%～65%，晝夜光線每12小時交替，喂養(yǎng)2周后，開展PD及LID大鼠模型制作。60只大鼠中隨機選取10只作為健康對照組，皮下注射安慰劑葵花油2 mg/kg，直至實驗結束；余50只大鼠首先制備PD模型。PD大鼠于頸背部皮下注射魚藤酮2 mg/kg，連續(xù)1周，根據(jù)大鼠行為變化分為6個等級：10分：瀕臨死亡狀態(tài)；8分：單側(cè)前肢或后肢癱瘓，四肢痙攣，體重較前減輕且>50%，無法進食；6分：單側(cè)前肢或后肢癱瘓，出現(xiàn)行走困難，且體重較前減輕>30%且≤50%，進食減少且困難；4分：自主活動較前減少，出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)或震顫，行走緩慢，且單側(cè)斜臥，體重較前減輕>20%且≤30%；2分：拒捕行為較前減弱，毛色變黃，毛質(zhì)變軟，出現(xiàn)動作緩慢，輕度震顫或步態(tài)不穩(wěn)，體重較前減輕>10%且≤20%；1分：拒捕行為，色變黃，毛質(zhì)變軟，活動減少，體重減輕<10%。以大鼠行為評分2～6分作為PD納入標準，共36只大鼠成功制備PD模型。成功制備PD模型3 d后，選取26只大鼠作為LID組大鼠模型，采用乙醚麻醉待手術后大鼠，腦立體定向儀將大鼠頭顱固定在操作臺上，頭頂及后腦備皮，經(jīng)大腦后正中線剪約2 cm刀口，眼科鑷分離皮下組織，采用紗布蘸取生理鹽水擦拭前囟，滅菌玻璃微量吸液管通過長管注射器鏈接，經(jīng)大鼠前囟左或右0.9 mm，下1.5 mm，穿刺滲透大鼠頭骨2～3 mm，

5 min后緩慢注入L-dopa 10 mg+Benserazide 3.0 mg/kg，

連續(xù)2 d，1次/d，評定結果須達到異動癥（AIM）評分標準。異動癥（AIM）評分參考Monville標準，共由4個部分組成：軸性即頸部和對側(cè)上體出現(xiàn)扭曲姿勢；口面部即下頜運動及舌頭向口外伸出；運動即與對側(cè)出現(xiàn)轉(zhuǎn)向運動；上肢即對側(cè)前肢出現(xiàn)重復無目的動作[5]。據(jù)此進行評定，數(shù)據(jù)順序亦按此進行記錄，每部分的評分等級根據(jù)行為學的有無及不自主運動的嚴重程度來劃分。采用link評分法分為5級：4分為持續(xù)存在，刺激不可使之停止；3分為繼續(xù)存在，刺激可以停止；2分為經(jīng)常出現(xiàn)，超過50%的觀察時間；1分為偶爾出現(xiàn)，少于50%的觀察時間；0分為未出現(xiàn)。LID模型成功標準：以30 min為觀察時間，分3次進行，均在給藥后觀察獲得AMI評分，AMI評分中4項評分均≥1分作為LID大鼠成功制備標準。

1.3 Western Blot技術檢測大鼠紋狀體S6K的Thr389、S6Ser240/244表達及mTOR的蛋白活性 三組大鼠均在藥物干預最后1 d準備凍存管，三組大鼠在末次用藥2 h后快速斷頭，置于冰上小心操作，解剖出右側(cè)紋狀體后，立刻稱重并記錄，采用液氮快速凍存。依據(jù)大鼠的總重量配置RIPA裂解液量，加入RIPA裂解液，研磨，提取蛋白，BCA法定量后采用SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)到PVDF膜上（100 V，120 min），5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入Thr389（1︰10 000）、S6Ser240/244（1︰10 000）抗體、p70S6K（1︰1 000）、GAPDH抗體（1︰2 000），4 ℃恒溫下孵育過夜。TBST洗膜3次，用時10 min/次，加入HRP標記的二抗（1︰5 000），37 ℃恒溫下孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光法發(fā)光，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描目的條帶后分析，以GAPDH作為內(nèi)參照，以陽性條帶/GAPDH條帶光密度比值作為蛋白的相對表達量，測定獲得Thr389、S6Ser240/244表達水平及p70S6K的蛋白活性。

1.4 免疫組織化學檢測AMPA受體亞基GluR1、GluR2水平 取保存好的大鼠紋狀體石蠟切片，中溫50 ℃烘烤溶解，冷卻后酒精去蠟，置于蒸餾水中清洗15 min后以高溫75 ℃浸泡15 min，然后以PBS漂洗3次，置于準備好的試管中以封閉液封閉。2 h后滴入單抗GluR1（1︰50）、GluR2（1︰3 000），4 ℃孵育過夜。37 ℃保溫半小時，取出PBS漂洗3次，然后滴入IgG抗體（1︰200）150 ?L，置于室溫中，2 h后PBS漂洗3次，玻片濾干后室溫下滴入顯色劑，首次染色完畢后漂洗，滴入第二次顯色劑，室溫干燥過夜，脫水后以pH 7.0樹脂封玻片，在光學顯微鏡下高倍視野觀察GluR1、GluR2陽性細胞。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型制備情況 對照組10只大鼠均完成各項實驗研究；50只研究組大鼠成功制備為PD模型36只，36只PD模型大鼠中26只用于LID模型制備，成功14只。參與最終實驗研究的大鼠分別為：對照組（n=10），PD組（n=10），LID組（n=14）。

2.2 三組大鼠Thr389、S6Ser240/244表達及mTOR的蛋白活性比較 LID組大鼠Thr389、S6Ser240/244表達及代表mTOR蛋白活性p70S6K表達均明顯高于PD組及對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；PD組大鼠Thr389、S6Ser240/244表達及代表mTOR蛋白活性p70S6K表達均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 三組AMPA受體亞基GluR1、GluR2陽性細胞數(shù)比較 三組均出現(xiàn)GluR1、GluR2表達，高倍視野（×200）下，LID組GluR1、GluR2陽性細胞數(shù)均明顯高于PD組及對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；PD組GluR1、GluR2陽性細胞數(shù)均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)LID大鼠紋狀體經(jīng)4E-BP 1和p70S6K兩個效應分子途徑而激活mTOR通路，mTOR經(jīng)磷酸化S6K的Thr389位點激活S6K，S6K激活后磷酸化Ser240/244和Ser235/236位點，致使Ser240/244

和Ser235/236位點表達上升[6-8]。另外mTOR還可通過磷酸化4E-BP 1的Ser65位點，激活4E-BP 1，釋放eIF4E（真核細胞翻譯啟始因子4E），發(fā)揮調(diào)節(jié)mRNA的起始翻譯，實現(xiàn)調(diào)節(jié)興奮性突觸可塑性介導的主要受體，如NR1、NR2和NR3表達。NR2又有NR2A和NR2B等不同亞型，NR1是功能亞單位，NR2和NR3是調(diào)節(jié)亞單位，它們不同的組合形成不同的四聚體，其功能與活性亦不同，但均不同程度上影響了神經(jīng)元突觸的興奮性[9]。因而檢測Ser240/244、Thr389的磷酸化表達水平差異可反應S6K通路的激活程度，輔助判斷引發(fā)LID可能機制。p70S6K及4E-BP 1是細胞轉(zhuǎn)錄過程的關鍵調(diào)節(jié)分子，是mTOR下游的直接靶分子，mTOR特異性磷酸化位于p70S6K的389位點的蘇氨酸，檢測p70S6K水平可特異性反應mTOR蛋白分子活性[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)LID組大鼠Thr389、S6Ser240/244表達及代表mTOR蛋白活性p70S6K表達均明顯高于PD組及對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；PD組大鼠Thr389、S6Ser240/244表達及代表mTOR蛋白活性p70S6K表達均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明左旋多巴誘發(fā)異動癥中mTOR信號顯著激活，其可能是經(jīng)由激活Thr389位點而激活S6K，間接激活S6Ser240/244位點，引發(fā)帕金森病及左旋多巴誘發(fā)異動癥[11-13]。臨床許多病理進程是由一種或多種突出后神經(jīng)遞質(zhì)受體的故障互相關聯(lián)，有研究發(fā)現(xiàn)紋狀體神經(jīng)元破壞S6K及Thr通路的相互作用可降低藥物誘導下的LID及PD的進展及嚴重程度[14]。突觸蛋白的功能主要為特異性轉(zhuǎn)運，S6K及Thr通路的激活可改變突觸可塑性的可能，進而誘導突觸結構或突觸單元異化，這可能是左旋多巴誘發(fā)異動癥的直接機理。即mTOR磷酸化而活化，Thr389被激活，進而激活S6K，引發(fā)S6Ser240/244激活，后大量釋放eIF4E，突觸神經(jīng)元可塑性被提升，引發(fā)突出元異化或結構失衡，導致PD發(fā)生及進展為LID。

AMPA是一種閉合速度快、對中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸信號傳遞具有顯著作用的受體。神經(jīng)系統(tǒng)突觸后膜的AMPA受體亞基GluR1、GluR2隨著信號的刺激發(fā)生數(shù)量級狀態(tài)的變化，從而導致功能的變化[13，15]。有研究表示，長時程增強作用（long-term potentiation，LTP）模型中皮質(zhì)紋狀體突觸內(nèi)NMDA受體NR2A亞單位和AMPA受體GluR2、GluR3亞單位含量明顯增加，而且對AMPA受體增加拮抗劑后，模型中LID的發(fā)生明顯減弱[16-19]。從本文研究可知，受mTOR信號通路的激活，三組AMPA受體亞基GluR1、GluR2均有表達，但是LID組均明顯高于其他兩組，PD組也明顯高于對照組，這表示，隨著mTOR信號通路的激活，信號傳入大鼠中樞神經(jīng)突觸后膜，引起AMPA受體亞基GluR1、GluR2數(shù)量增加，功能增強，可見AMPA受體功能增強在LID產(chǎn)生中起重要作用。

綜上所述，本研究通過大鼠動物模型實驗探討mTOR信號通路在LID中的作用及可能機制，結果顯示，PD及LID大鼠mTOR經(jīng)磷酸化而活化，引發(fā)S6Ser240/244激活，導致突觸神經(jīng)元異常。而且PD及LID大鼠mTOR激活后，其AMPA受體亞基的GluR1、GluR2功能增強，均提示mTOR信號的激活參與了LID的發(fā)生，因此可能成為研究藥物治療LID的新靶標。

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（收稿日期：2018-05-14） （本文編輯：李瑩瑩）