基于星點設計
——效應面法和正交設計的中藥類風濕復方提取工藝研究

朱紅梅， 王 姚， 曾奇璐， 楊 慧， 曹 鑫

(成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106)

0 引 言

中藥類風濕復方由青風藤、延胡索、海桐皮、片姜黃4味藥材組成.青風藤性平，味辛苦，入脾、肝，祛風濕，通經(jīng)絡，常用于風濕痹痛，關節(jié)腫脹，麻痹瘙癢，為君藥；延胡索性溫，味辛苦，具活血行氣，止痛之功，為臣藥；片姜黃性溫味辛，具破血行氣、通經(jīng)止痛之力，為佐藥；海桐皮性平，味辛苦，能祛風除濕，常用于風濕關節(jié)痛，腰腿酸痛，引藥入經(jīng)，為使藥.四藥合用，互相協(xié)同，具有祛風除濕，消炎止痛之效，可治療風濕性關節(jié)炎、風濕痛等癥[1].中藥復方的提取工藝對復方藥效有著重要的影響，目前的研究多以指標成分來確定復方提取工藝路線.星點設計是在二水平析因設計的基礎上加上星點及中心點而成的實驗次數(shù)較少、適宜進行非線性擬合的實驗設計方法，已廣泛應用于制劑工藝優(yōu)化的各個環(huán)節(jié)[2-4].

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：青風藤(批號，54191101)、片姜黃(批號，20170226)，購自北京同仁堂北京三和藥業(yè)有限公司；延胡索(批號，20170220)，購自成都市荷花池中藥材市場；海桐皮(批號，501002448)，購自北京同仁堂亳州飲片有限公司；青藤堿(批號，wkp16031603，HPLC>98%)、延胡索乙素(批號，141021，HPLC>98%)、吉馬酮對照品(批號，150810，HPLC>98%)，購自四川省維克奇生物科技有限公司；95%乙醇、氨水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三乙胺、無水乙醇、氨水、甲醇、磷酸，購自成都科龍化工試劑廠.HPLC用甲醇、乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：BS-6KH電子天平(上海友聲衡器有限公司)；BJ-150型高速多功能粉碎機(拜杰公司)；FA-2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn))；P-230 II型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；101-1-S型電熱鼓風干燥箱(成都雅源科技有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；DZTW型電子調溫電熱套(天津靜?？h工興電器廠)；酒精計(武強同輝儀表廠).

2 方法與結果

2.1 指標成分的測定

2.1.1 青藤堿.

1)色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗.以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇—磷酸鹽緩沖液(0.005 mol/L磷酸氫二鈉溶液，以0.005 mol/L磷酸二氫鈉調節(jié)pH值至8.0，再以1%三乙胺調節(jié)pH值至9.0)(55∶45)為流動相，檢測波長為262 nm，流速為1 mL/min[1].

2)對照品溶液的制備.取青藤堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.7184 mg的對照品溶液.精密量取上述對照品溶液，配制成濃度分別為0.3592 mg/mL、143.68 μg/mL、57.472 μg/mL、28.736 μg/mL的對照品溶液.

3)線性關系考察.分別吸取上述5種對照品溶液，按照“2.1.1"項下色譜條件進樣，測定峰面積.以峰面積為縱坐標，青藤堿進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為，Y=1008.9X+2.6597(R2=0.9998).結果表明，青藤堿在0.2873～7.184 μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好線性關系.

4)供試品溶液的制備.取提取液適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得.

2.1.2 延胡索乙素.

1)色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗.以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺調節(jié)pH值至6.0)(65∶35)為流動相，檢測波長為280 nm，流速為1 mL/min[1].

2)對照品溶液的制備.取延胡素乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5328 mg的對照品溶液.精密量取上述對照品溶液，配制成濃度分別為0.2664 mg/mL、106.56 μg/mL、42.624 μg/mL、21.312 μg/mL的對照品溶液.

3)線性關系考察.分別吸取上述5種對照品溶液，按照“2.1.2"項下色譜條件進樣，測定峰面積.以峰面積為縱坐標，延胡索乙素進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為，Y=725.65X+15.741(R2=0.9999).結果表明，延胡索乙素在0.213～5.328 μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好線性關系.

4)供試品溶液的制備.取提取液適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得.

2.1.3 吉馬酮.

1)色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗.以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈—水(60∶40)為流動相，檢測波長為215 nm，流速為1 mL/min[1].

2)對照品溶液制備.取吉馬酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含367.2 μg的對照品溶液.精密量取上述對照品溶液，配制成濃度分別為73.44 μg/mL、29.376 μg/mL、14.688 μg/mL、5.8275 μg/mL的對照品溶液.

3)線性關系考察.分別吸取上述5種對照品溶液，按照“2.1.3"項下色譜條件進樣，測定峰面積.以峰面積為縱坐標，吉馬酮進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為，Y=2881.9X+11.709(R2=1).結果表明，吉馬酮在0.058～3.672 μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好線性關系.

4)供試品溶液的制備.取提取液適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得.

2.1.4 固含物量測定.

精密量取4味藥材的提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干后，于干燥箱中105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量.

2.2 星點設計——效應面法

2.2.1 單因素實驗.

1)乙醇濃度考察.研究表明，青風藤、延胡索、海桐皮主要成分均為生物堿[5-9]，且多采用乙醇為溶媒提取，故本研究同樣選擇乙醇溶液為溶媒.稱取青風藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分別用8倍50%、60%、70%、80%、90%的乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，濾過，合并提取液.按照“2.1"項下的方法測定青藤堿、延胡索乙素的含量和固含物量.結果按青藤堿量—延胡索乙素量—固含物量=35∶35∶30進行綜合評分計算，結果見圖1.結果表明，綜合評分分數(shù)先是隨乙醇濃度增大而增加，后隨之下降，當乙醇濃度為70%時，綜合評分最高，故將70%乙醇定為提取溶媒.

2)乙醇用量考察.稱取青風藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分別用4、6、8、10、12倍70%的乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，濾過，合并提取液.按照“2.1"項下的方法測定，結果見圖1.結果表明，綜合評分分數(shù)先是隨乙醇用量增大而增加，后隨之下降，當溶媒倍數(shù)為8倍時，提取液綜合評分最高，故將提取的溶媒倍數(shù)定為8倍.

3)提取時間考察.稱取青風藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分別用8倍50%的乙醇加熱回流提取3次，每次分別0.5、1、1.5、2、2.5 h，濾過，合并提取液.按照“2.1"項下的方法測定，結果見圖1.結果表明，當提取時間為1 h時，提取液綜合評分最高，故選擇提取時間為1 h.

4)提取次數(shù)考察.稱取青風藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分別用8倍50%的乙醇加熱回流提取1、2、3、4次，每次1 h，濾過，合并提取液.按照“2.1"項下的方法測定，結果見圖1.結果表明，當提取次數(shù)為3時綜合評分最高，故將提取次數(shù)定為3次.

圖1乙醇濃度(A)、溶劑用量(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)對綜合評分的影響

2.2.2 星點設計——效應面法優(yōu)化提取工藝.

以乙醇濃度(A)(50%～90%)，溶媒倍數(shù)(B)(8～12倍)，提取時間(C)(30～90 min)為考察因素，以指標成分青藤堿、延胡索乙素的含量和固含物量的綜合評分為評價指標.稱取青風藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，按照星點設計——效應面法安排實驗.實驗因素水平表見表1，實驗分組與結果見表2.

表1 實驗因素水平表

1)模型擬合與預測評價.采用Design-Expert V8.0.6軟件，以各綜合評分值對自變量進行多元線性回歸和二項式擬合[10]，線性方程為，

Y=96.09635-0.5033X1+0.91854X2+

10.0096X3

(R2=0.5319，P=0.0059)

二項次方程為：

Y=211.79685+0.4989X1-15.6395X2-

122.33112X3+(5.48008E-0.03)X1X2+

0.71771X1X3+11.00258X2X3-

(R2=0.7336，P=0.0460)

根據(jù)統(tǒng)計軟件對各項系數(shù)進行的t檢驗結果，

表2 實驗分組與結果

刪除P>0.5的項后，再進行二項式方程擬合，達到簡化模型目的，所得方程為，

Y=206.12217-0.5033X1-10.08404X2-

100.01622X3+11.00258X2X3

(R2=0.6346，P=0.0030)

從擬合方程相關系數(shù)可見，多元線性回歸方程的相關系數(shù)較低，而多元二項式擬合方程相關系數(shù)較高，擬合效果較好.通過Design-Expert V8.0.6.軟件預測分析，獲得一組綜合評分響應值最大的優(yōu)化條件為：X1為50.00%，X2為8.00倍，X3為0.66 h.

2)驗證實驗.稱取青風藤45 g、延胡索30 g、海桐皮45 g，用8倍50%的乙醇加熱回流提取3次，每次40 min，濾過，合并提取液，平行3次.按照“2.1"項下的方法測定青藤堿、延胡索乙素的含量以及固含物量，并將預測值與實測值進行偏差計算，結果見表3.

表3 驗證實驗結果

注:偏差=(預測值-實測值)/預測值×100%

由表3可知，預測值與實測值間的偏差的平均值為11.31%，綜合評分RSD為1.92%.結果表明，采用星點設計——效應面法選擇的中藥類風濕復方提取工藝重復性好，擬合結果合理、可靠穩(wěn)定.

2.3 正交設計

2.3.1 單因素實驗(藥材粒徑考察).

取片姜黃藥材(直徑約為1 cm)、片姜黃粗粉各50 g，以70%的乙醇滲漉，滲漉速度為3 mL/min，收集400 mL滲漉液.按照“2.1"項下的方法測定吉馬酮量和固含物量，結果見表4.結果表明，當藥材大小為粗粉時，吉馬酮量和固含物量最高，故選擇藥材粗粉進行提取研究.

表4 片姜黃滲漉藥材大小考察

2.3.2 正交設計優(yōu)化提取工藝.

以乙醇濃度(A)，滲漉速度(B)，滲漉液的量(C)為考察因素，以指標成分吉馬酮量和固含物量的綜合評分為評價指標.分別稱取片姜黃藥材粗粉各50 g，按照L9(34)正交表安排實驗.因素水平表見表5，正交試驗設計與結果見表6，方差分析見表7.

表5 正交試驗因素水平表

表6 正交試驗設計與結果

表7 方差分析

由表6、7結果可知，各因素對提取的影響程度為C>A>B，且各因素對提取效果的影響均無顯著性影響.因此，根據(jù)K值并結合工業(yè)大生產(chǎn)實際，確定最佳工藝為A2B3C3，即60%乙醇滲漉提取，滲漉速度3 mL/min，收集8倍量濾液.

2.3.3 驗證實驗.

取片姜黃藥材粗粉50 g，平行3組，按照正交試驗優(yōu)選的最佳提取工藝條件進行驗證實驗，結果見8.

表8 片姜黃提取工藝驗證實驗結果

由表8可知，吉馬酮含量RSD為2.29%，固含物量RSD為1.88%，表明所選工藝穩(wěn)定可行.

3 討 論

中藥類風濕復方由青風藤、延胡索、海桐皮、片姜黃4味藥材組成，臨床上多將該4味藥材用酒浸泡后成藥酒涂抹于病變處.相關研究表明，青風藤、延胡索、海桐皮主要成分均為生物堿，且多采用乙醇為溶媒回流提取.本研究結合藥材有效成分提取工藝并考慮實際生產(chǎn)成本等因素，將青風藤、延胡索和海桐皮一起提取，采用單因素實驗和星點設計——響應面法結合的方式對藥材的提取工藝進行研究，對片姜黃采用乙醇滲漉提取，并采用單因素實驗和正交試驗相結合的方式對藥材的提取工藝參數(shù)進行研究.

星點設計——效應面優(yōu)化青風藤、延胡索、海桐皮提取工藝，預測值與實測值間的偏差平均值為11.31%，略大，可能的原因為驗證實驗與工藝優(yōu)化工藝時間間隔較長.驗證實驗綜合評分RSD為1.92%，較穩(wěn)定，表明采用星點設計——效應面法選擇的中藥類風濕復方提取工藝重復性好，擬合結果合理，可靠穩(wěn)定.正交設計方差分析結果顯示，因素無顯著性影響(P>0.05)，本研究則根據(jù)K值并結合生產(chǎn)需要確定提取工藝，并進行驗證實驗，表明正交設計所選工藝穩(wěn)定可行.本研究所確定的中藥類風濕復方提取工藝穩(wěn)定可行.