基于生物信息學(xué)驗(yàn)證海桐皮-透骨草抑制炎性軟骨細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制

摘要：基于生物信息學(xué)驗(yàn)證海桐皮-透骨草（復(fù)方海桐皮）抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠炎性軟骨細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制。通過生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)骨關(guān)節(jié)炎鐵死亡的相關(guān)作用機(jī)制，確定待驗(yàn)證通路。利用相關(guān)試劑盒檢測(cè)亞鐵離子濃度、還原型谷胱甘肽（GSH）質(zhì)量分?jǐn)?shù)；利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)加藥后細(xì)胞活力和相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的質(zhì)量濃度；蛋白免疫印跡法（Western -Blot）檢測(cè)各組NLRP3炎癥小體通路相關(guān)的蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC以及抑制鐵死亡的基因GPX4蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞鐵離子濃度顯著降低，GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物各組與模型組相比IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子質(zhì)量濃度均降低；WB結(jié)果顯示，藥物各劑量組與模型組相比，NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達(dá)水平顯著降低，GPX4蛋白表達(dá)水平顯著升高。復(fù)方海桐皮可以通過介導(dǎo)NLRP3炎癥小體通路對(duì)炎性軟骨細(xì)胞的鐵死亡進(jìn)行干預(yù)，從而達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的。

關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎；鐵死亡；海桐皮-透骨草；生物信息學(xué)；NLRP3炎癥小體通路

中圖分類號(hào)：R285;R289""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：1002-4026（2025）01-0023-09

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20240049【藥理與毒理】

收稿日期：2024-03-30

基金項(xiàng)目：國家中醫(yī)藥管理局全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（國中醫(yī)藥人教函［2019］41號(hào)）；成都醫(yī)學(xué)院應(yīng)用開發(fā)與成果轉(zhuǎn)化培育項(xiàng)目（CYCG19-01）；四川省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（S202313705037）

作者簡(jiǎn)介：徐夢(mèng)雨（2003—）， 女，本科，研究方向?yàn)樗帉W(xué)。E-mail：2459331059@qq.com

*通信作者，游元元（1974—），女，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)與藥效。E-mail：ym633@sina.com，Tel：15308089262

Bioinformatics-based verification of the mechanism of Haitongpi-Tougucao

in inhibiting ferroptosis in inflammatory chondrocytes

XU Mengyu，WU Tianju，HUANG Lu，LIU Xin，ZHAO Jiarong，YOU Yuanyuan*

（School of Pharmacy， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China）

Abstract∶Based on bioinformatics， this study validates the mechanism of action of Haitongpi-Tougucao （compound Haitongpi） in inhibiting lipopolysaccharide （LPS）-induced ferroptosis in rat inflammatory chondrocytes. Bioinformatics tools were used to predict the mechanism of action of ferroptosis in osteoarthritis and identify pathways for validation. The key techniques used were as follows： the detection of ferrous ion content and reduced glutathione （GSH） content using relevant kits; the detection of cell viability and the levels of related cytokines IL-1β， IL-6， and TNF-α using the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） after dosing; and the use of protein immunoblotting （western blot， WB） to detect the protein expression levels of NLRP3， Caspase-1， ASC， and GPX4， a gene that inhibits ferroptosis， related to the NLRP3 inflammasome pathway in each group. The results revealed that the ferrous ion content was significantly decreased，while the GSH content was significantly increased; the ELISA experiment showed that the levels of inflammatory factors IL-1β， IL-6， and TNF-α were decreased in each group administered with the drug compared with those in the model group; the WB results showed that the expression levels of NLRP3， Caspase-1， and ASC proteins were significantly decreased and GPX4 protein expression levels were significantly increased in each group administered with a specific dosage of the drug compared with those in the model group. Therefore， the compound Haitongpi can intervene in the ferroptosis of inflammatory chondrocytes by mediating the NLRP3 inflammasome pathway， thereby achieving the purpose of osteoarthritis treatment.

Key words∶osteoarthritis; ferroptosis; Haitongpi-tougucao; bioinformatics; NLRP3 inflammasome pathway

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種好發(fā)于中老年人的慢性關(guān)節(jié)性疾病，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)部位的疼痛、僵硬、腫脹或畸形［1］，其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增高。我國已步入老齡化社會(huì)，疊加肥胖等危險(xiǎn)因素，OA患病人群會(huì)進(jìn)一步增加［2］。目前OA尚無根治方法，西醫(yī)臨床的用藥目標(biāo)是以控制疼痛、緩解癥狀為主，但長(zhǎng)期用藥毒副作用較明顯［3-4］。

骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)理論中的“骨痹”，中醫(yī)臨床有豐富的治療經(jīng)驗(yàn)，其中海桐皮、透骨草兩味中藥既是熏洗法治療OA的經(jīng)典名方“海桐皮湯”中的主要藥味［5］，也是與其它中藥配伍外治OA的高頻藥物［6-7］。海桐皮為袪風(fēng)逐濕之品，能除風(fēng)濕之害，理腰膝之疼［8］；透骨草具暖筋透骨之效，可洗風(fēng)寒濕痹，緩筋骨疼痛［9］。但二者治療OA的作用機(jī)制尚不明確。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)OA與鐵死亡具有一定相關(guān)性［10-11］。鐵過載可調(diào)動(dòng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)活性氧含量激增，激活NLRP3炎癥小體通路，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡［12-13］。本研究借助生物信息學(xué)手段篩選OA與鐵死亡相關(guān)的潛在靶點(diǎn)與通路，并通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證海桐皮-透骨草抑制炎性軟骨細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制，以期為兩味中藥的臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1" 實(shí)驗(yàn)材料

1.1" 藥材

海桐皮采自成都醫(yī)學(xué)院校園內(nèi)，鳳仙透骨草購自荷花池藥材市場(chǎng)。經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院游元元教授鑒定，分別為豆科植物刺桐Erythrina variegata L.的樹皮、鳳仙花科植物鳳仙花Impatiens balsamina L.的干燥莖。

1.2" 細(xì)胞株

SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.3" 試劑

細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒（Cell Counting Kit-8，批號(hào)K1018，APEXBIO）；TNF-α酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒（R1393H061，20220606，F(xiàn)ineTest）；IL-1β酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒（R1393G059，20220606，F(xiàn)ineTest）；IL-6酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒（R1393G062，20220606，F(xiàn)ineTest）；還原型谷胱甘肽（GSH）含量檢測(cè)試劑盒（20221221，索萊寶）；亞鐵離子比色法測(cè)試盒（20230627，Elabscience）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（BL521A，20221101，Biosharp）；兔抗鼠GPX4單克隆抗體（20230109R，DF6701，Affinity Biosciences）；兔抗鼠NLRP3單克隆抗體（20230109R，DF5418，Affinity Biosciences）；兔抗鼠Caspase-1單克隆抗體（20230109R，DF6252，Affinity Biosciences）；兔抗鼠TMA1/ASC單克隆抗體（20230109R，DF6304，Affinity Biosciences）；兔抗鼠IL-18單克隆抗體（20230109R，DF6346，Affinity Biosciences）；羊抗兔 IgG（H+L）二抗試劑盒（20230109R，DF5096，Affinity Biosciences）。

1.4" 儀器

熒光倒置顯微鏡（AE2000，中國Motic）；多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax Mini，美國Molecular Devices）；流式細(xì)胞儀（NovoCyte 2060R，艾森生物）；生物安全柜（1300型I級(jí)A2型，美國Thermo Fisher Scientific）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Froma 3111，美國Thermo Fisher Scientific）；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Mini-PROTEAN Tetra，美國Bio-Rad ）；凝膠圖像處理系統(tǒng)（Universal Hoof V，美國Bio-Rad）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-200B，上海智城公司）。

2" 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 "生物信息學(xué)處理方法獲取研究靶點(diǎn)

利用FerrDb v2數(shù)據(jù)庫（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）檢索鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)基因，包括Driver（促進(jìn)鐵死亡的基因）、Suppressor（抑制鐵死亡的基因）、Marker（指示鐵死亡發(fā)生的基因）。利用GeneCard數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（ https：//www.disgenet.org/）OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：// www.Omim. org/）、PharmGKB數(shù)據(jù)庫（https：//www. pharmgkb. org/）、TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db. idrblab. net/ttd/）搜集OA的相關(guān)靶點(diǎn)基因。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將查詢到的疾病靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為UniProt ID，通過BioinfoGP數(shù)據(jù)庫（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools.html）的在線工具Venny 2.1軟件對(duì)鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)與OA的相關(guān)靶點(diǎn)基因整合取合集，得到鐵死亡與OA相關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)，通過KEGG分析后篩選得到潛在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2.2 "藥液制備

取海桐皮、透骨草粗粉各約2.0 g，1：1配伍，采用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇加熱回流提取兩次，每次60 min，濃縮提取液為干浸膏。取浸膏50 mg，精密稱定，二甲基亞砜（DMSO）溶解。按照DMSO占比千分之一的比例，加入99.9 mL含血清完全培養(yǎng)基配制成含藥0.5 μg/mL的培養(yǎng)基，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后作為給藥組的含藥母液，4 ℃低溫冷藏。

將母液濃度為100 mmol/mL的N-乙酰-L-半胱氨酸配置成濃度為10 mmol/mL的含藥培養(yǎng)基過濾除菌后作為陽性對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)液，4 ℃低溫避光冷藏。

2.3" 實(shí)驗(yàn)分組和炎癥模型的建立

第8代軟骨細(xì)胞鋪于6孔板和96孔板于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞鋪滿各孔底80%～90%后觀察其細(xì)胞形態(tài)并記錄。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定由脂多糖誘導(dǎo)的炎性關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的最佳造模質(zhì)量濃度為200 μg/mL。將6孔板細(xì)胞分別設(shè)置為空白組（Blank）、陽性對(duì)照組（Positive Control）、模型組（Model）、高劑量組（High）、中劑量組（Middle）及低劑量組（Low）。96孔板細(xì)胞分別設(shè)置為空白組、陽性對(duì)照組、模型組以及17個(gè)梯度濃度組。除空白組加入空白培養(yǎng)基外，其余各組孔均加入200 μg/mL脂多糖的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)。

2.4" 藥物最佳治療濃度確定

待2.3節(jié)鋪得的96孔板細(xì)胞培養(yǎng)24 h，使用PBS洗滌后向空白組和模型組中加入空白培養(yǎng)基100 μL，向陽性對(duì)照組中加入濃度為10 mmol/mL的陽性藥物培養(yǎng)基100 μL。其余17個(gè)藥物梯度濃度組分別加入預(yù)設(shè)定藥物質(zhì)量濃度的培養(yǎng)液100 μL（預(yù)設(shè)質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500 ng/mL），除空白組和模型組復(fù)孔數(shù)為3外，其余藥物組復(fù)孔數(shù)為5。培養(yǎng)24 h后使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖毒性指標(biāo)以確定最適藥物濃度范圍。

2.5" 細(xì)胞分組給藥

根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)所測(cè)得結(jié)果，選取OD值前三的藥物組分別設(shè)置為本實(shí)驗(yàn)給藥方案中的高劑量、中劑量、低劑量組。使用2.2節(jié)所鋪6孔板細(xì)胞分組給藥。

2.6" 鐵死亡指標(biāo)檢測(cè)

2.6.1" ELISA檢測(cè)炎癥因子指標(biāo)

按照檢測(cè)試劑盒方法檢測(cè)各藥物組細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α及IL-6的表達(dá)量。

從室溫平衡 20 min 后的鋁箔袋中取出所需板條。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育 60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min 內(nèi)在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。在Excel 工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD 值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本質(zhì)量濃度值。

2.6.2" 亞鐵離子濃度檢測(cè)

按照亞鐵離子比色法測(cè)試盒說明書測(cè)定樣品中亞鐵離子濃度。

收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，取約5×106個(gè)細(xì)胞加入1 mL 提取液，超聲波破碎細(xì)胞（冰浴，功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次），12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清測(cè)定。酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min， 設(shè)定波長(zhǎng)到562 nm。所有試劑解凍至室溫，在測(cè)定管中加入樣本120 μL、試劑二

260 μL、試劑三20 μL；標(biāo)準(zhǔn)管中加入標(biāo)準(zhǔn)品120 μL、試劑二260 μL、試劑三20 μL；空白管中加入蒸餾水120 μL、試劑二260 μL、試劑三20 μL。充分混勻，置室溫15 min 后，取200 μL上清液至96孔板中，于波長(zhǎng) 562 nm 處讀取各管吸光度。按照下式計(jì)算亞鐵離子濃度（μmol/L）：

亞鐵離子濃度=［（y-b）/a］×4，

其中，a、b、y為標(biāo)準(zhǔn)品擬合曲線y=ax+b。

2.6.3" 還原型谷胱甘肽含量檢測(cè)

按照谷胱甘肽測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定樣本中谷胱甘肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

按照細(xì)胞數(shù)量（106個(gè)）：試劑一體積（mL）10：1的比例反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，取上清置于冰上待測(cè)。酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412 nm。吸取10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水稀釋至300、200、100、50、25 μg/mL。在測(cè)定孔中加入樣本20 μL、試劑二140 μL、試劑三40 μL；標(biāo)準(zhǔn)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL、試劑二140 μL、試劑三40 μL；空白孔中加入蒸餾水20 μL、試劑二140 μL、試劑三40 μL?；靹蚝蟪仂o置2 min 后測(cè)定412 nm 處各孔的

光密度，分別記為ODm（測(cè)量孔光密度）、ODb（空白孔光密度）、ODs（標(biāo)準(zhǔn)孔光密度），計(jì)算△OD=ODm-ODb，△ODs=ODs-ODb。 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的質(zhì)量濃度（x，μg/mL）和吸光度△OD標(biāo)準(zhǔn)（y，△ODs），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/mg） =x ×V樣/（V樣×Cpr） =x/Cpr，

其中，V樣為加入體系中上清液體積，mL；Cpr為上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL，需要另外測(cè)定。

2.6.4" 蛋白免疫印跡法測(cè)定軟骨細(xì)胞NLRP-3炎癥小體蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取定量后等質(zhì)量的6組蛋白上樣，電泳儀電壓設(shè)置為100 V，運(yùn)行20 min后降為150 V，運(yùn)行70 min至分

離膠底部結(jié)束電泳。以100 mA的穩(wěn)定電流、90 min的運(yùn)行條件將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后置于封閉液中，搖床室溫封閉1.5 h，TBST清洗6次，每次5 min。分別置于NLPRP-3（稀釋比例為1∶

2 000）、ASC（稀釋比例為1∶2 000）、Caspase-1（稀釋比例為1∶2 000）的一抗溶液中，4 ℃搖床孵育16 h。TBST清洗6次，每次5 min。置于二抗溶液（稀釋比例為1∶5 000），搖床常溫孵育2 h，TBST清洗6次，每次5min?；瘜W(xué)凝膠成像發(fā)光儀曝光測(cè)定目的蛋白的表達(dá)程度。

2.7" 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，x±s表示計(jì)量的數(shù)據(jù)資料，方差分析比較兩個(gè)樣本之間的差異性，以樣本數(shù)據(jù)中的Plt;0.05或Plt;0.01表示得出的差異資料具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3" 結(jié)果與結(jié)論

3.1" ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)

從FerrDb v2數(shù)據(jù)庫中共搜集整合到與鐵死亡有關(guān)的靶點(diǎn)486個(gè)。從5個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫中搜集、整合、篩選到2 568個(gè)共有靶點(diǎn)與OA的發(fā)生或發(fā)展有關(guān)。Venny 2.1軟件對(duì)鐵死亡靶點(diǎn)與OA的相關(guān)靶點(diǎn)基因取交集，得到鐵死亡與OA關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)分析網(wǎng)絡(luò)并繪制Venn 圖（圖1），分析結(jié)果得到潛在交集靶點(diǎn)共有143個(gè)，交集程度較高的幾個(gè)靶點(diǎn)為IL-6、HIF1A、TP53、PIK3CA、HMOX1、SMPD1、TF、G6PD、ATF4、IL-1β、IL-18、TNF-α等。KEGG通路富集分析結(jié)果篩選得到66條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括生理代謝通路、激素生成調(diào)節(jié)通路、壞死通路、NLRP3炎癥小體通路、癌癥信號(hào)通路、胃泌素通路、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)等，其中NLRP3炎癥小體信號(hào)通路與骨關(guān)節(jié)炎鐵死亡、凋亡、焦亡、氧化應(yīng)激、壞死等多種生物過程有關(guān)，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程的NLRP3炎癥小體信號(hào)通路包含NLRP3炎癥小體/IL-1β通路和NLRP3炎癥小體級(jí)聯(lián)通路，NLRP3炎癥小體通路圖結(jié)果見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。

3.2" 確定海桐皮-透骨草的最佳給藥質(zhì)量濃度

根據(jù)OD值設(shè)置高、中、低劑量組，利用熒光倒置顯微觀測(cè)正常軟骨細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)炎癥24 h后的軟骨細(xì)胞形態(tài)，與正常軟骨細(xì)胞相比，誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞多呈球狀，而正常細(xì)胞多呈現(xiàn)梭形。通過細(xì)胞形態(tài)的變化可判斷炎癥造模成功。

選取造模成功的細(xì)胞96孔板孵育40 min，使用酶標(biāo)儀重復(fù)測(cè)量細(xì)胞OD值3次，取3次測(cè)量結(jié)果的平均值，結(jié)果如圖2所示。模型組細(xì)胞OD值明顯低于空白組，說明細(xì)胞存活率明顯降低。藥物質(zhì)量濃度為1～100 ngmL范圍內(nèi)的藥物組細(xì)胞OD值均大于模型組，說明在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的藥物有一定抗炎作用。其中質(zhì)量濃度為20和10 ng/mL的實(shí)驗(yàn)組測(cè)定OD值均大于陽性對(duì)照組，推測(cè)海桐皮配伍透骨草的最佳治療濃度在此范圍之間。選取OD值前三的藥物質(zhì)量濃度20、10、2 ng/mL分別設(shè)置為高、中、低劑量組，為后續(xù)試驗(yàn)探究復(fù)方海桐皮對(duì)炎性軟骨細(xì)胞鐵死亡的干預(yù)作用是否呈現(xiàn)量效關(guān)系提供依據(jù)。

3.3" 藥物組存活率隨藥物濃度增大而提高

各組給藥24 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞存活狀態(tài)，結(jié)果如圖3所示。陽性對(duì)照組存活率最高，模型組存活率最低，空白組存活率低于陽性對(duì)照組，高于藥物組。藥物組存活率隨濃度增加而增加。

3.4" 炎癥因子水平變化

按照測(cè)定結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得

IL-1β： y=1.375 63+8.656 35 x+15.670 34 x2，r=0.999 0；

IL-6： y=0.434 58+14.595 3 x+9.532 53 x2，r=0.999 6；

TNF-α： y=0.102 74+58.531 36 x+46.017 06 x2，r=0.999 4。

根據(jù)標(biāo)曲和吸光度值計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組炎癥因子表達(dá)情況，模型組軟骨細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度明顯高于各組。用陽性藥物或者不同質(zhì)量濃度藥物進(jìn)行干預(yù)后，各藥物組軟骨細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量均明顯下降，各炎癥因子含量下降趨勢(shì)呈現(xiàn)一定量效關(guān)系，含藥質(zhì)量濃度越高下降趨勢(shì)越明顯，結(jié)果見圖4所示。

3.5" 鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3.5.1" 亞鐵離子濃度變化

測(cè)定不同亞鐵離子濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.018 7x -0.002 5，r=0.999。按同樣方法測(cè)定待測(cè)樣品OD值，并計(jì)算樣品亞鐵離子濃度，結(jié)果如表1所示。模型組的亞鐵離子濃度較空白組有顯著提高，陽性組在陽性藥物干預(yù)下亞鐵離子濃度下降較為明顯，藥物組降低亞鐵離子濃度具有一定量效關(guān)系，隨給藥劑量提高，亞鐵離子降低趨勢(shì)更明顯。

3.5.2" GSH（谷胱甘肽）質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

測(cè)定GSH不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.002 1x -0.002 6，r=0.999 8（y為△OD=ODm-ODb）。按同樣方法測(cè)定待測(cè)樣品OD值，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)試劑盒結(jié)果計(jì)算方法，計(jì)算樣品GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表2所示。模型組的GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)較空白組有顯著降低，陽性組在陽性藥物干預(yù)下GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高較為明顯，實(shí)驗(yàn)藥物組升高GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有一定量效關(guān)系，隨給藥劑量提高，GSH升高趨勢(shì)更明顯。

3.6" 藥物質(zhì)量濃度對(duì)ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)的影響

WB條帶結(jié)果如圖5所示，灰度定量分析結(jié)果如圖6所示。模型組中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達(dá)量上調(diào)，高于正常組，說明ROS-NLRP3通路蛋白表達(dá)較高。灰度分析發(fā)現(xiàn)，陽性對(duì)照組中蛋白表達(dá)量與空白組接近，說明陽性對(duì)照藥物對(duì)LPS致炎的軟骨細(xì)胞ROS-NLRP3通路表達(dá)有抑制作用。3個(gè)劑量的藥物組，NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)量均有所下降。除Caspase-1組的中劑量組表達(dá)略高于低劑量組，其他通路蛋白表達(dá)下調(diào)趨勢(shì)與濃度有關(guān)，藥物質(zhì)量濃度越高，蛋白下調(diào)作用越強(qiáng)。而GPX4表達(dá)情況與通路蛋白相反，模型組GPX4表達(dá)量較低且略低于空白組；陽性對(duì)照組GPX4表達(dá)上調(diào)明顯，高于藥物組；藥物組表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)呈現(xiàn)濃度依賴，高劑量組促進(jìn)表達(dá)作用更強(qiáng)。說明藥濃度較高可能會(huì)抑制ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路，抑制炎癥進(jìn)一步發(fā)展。同時(shí)可能通過該信號(hào)通路，調(diào)節(jié)GPX4的表達(dá)，抑制鐵死亡的發(fā)生與發(fā)展。

4" 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為OA是因正氣虧虛、瘀血阻絡(luò)、風(fēng)寒濕邪侵襲等病因病機(jī)引起的筋骨失養(yǎng)，常以活血化瘀、祛風(fēng)散寒、除濕止痛之品療之。海桐皮通絡(luò)止痛、祛風(fēng)除濕，透骨草溫經(jīng)通絡(luò)、活血止痛，二者均為OA外治法的高頻使用藥物。清代吳謙所著《醫(yī)宗金鑒》中收載的經(jīng)典名方“海桐皮湯”即以此兩味藥為組方之根本。

與OA病變高相關(guān)性通路中，NLRP3炎癥小體通路一方面通過激活NF-κB通路，進(jìn)而上調(diào)與炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)；另一方面促進(jìn)炎癥小體傳感蛋白與炎癥小體接頭蛋白的聚集，啟動(dòng)NLRP3、IL-1β、IL-18等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)促炎性細(xì)胞死亡［14-16］。另外，斑點(diǎn)樣蛋白ASC、Caspase-1等多種基因分子在炎癥、細(xì)胞凋亡等方面同樣發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)主要探討的機(jī)制是基于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎

癥小體通路進(jìn)行。NLRP3 是其炎癥小體中關(guān)鍵調(diào)控蛋白之一，其激活及其相關(guān)分

子調(diào)控信號(hào)通路與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是臨床藥物研究開發(fā)的前沿?zé)狳c(diǎn)方向［17-19］。

結(jié)合生物信息學(xué)工具分析，NLRP3炎癥小體通路對(duì)于炎性軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有一定調(diào)控作用，且與鐵死亡相關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該通路的方法是利用蛋白免疫印跡法（WB）驗(yàn)證NLRP3、Caspase-1、ASC等3個(gè)蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方海桐皮可顯著性降低軟骨細(xì)胞中上述3種蛋白的表達(dá)，當(dāng)上述3種蛋白表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞炎癥因子表達(dá)也會(huì)相應(yīng)下調(diào)，由此證明復(fù)方海桐皮確實(shí)可介導(dǎo)NLRP3炎癥小體通路實(shí)現(xiàn)抗炎目的。但具體是NLRP3炎癥小體/IL-1β通路主導(dǎo)還是NLRP3炎癥小體級(jí)聯(lián)通路主導(dǎo)仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)復(fù)方海桐皮可通過介導(dǎo)NLRP3炎癥小體通路影響軟骨細(xì)胞的鐵死亡，從而影響細(xì)胞炎癥發(fā)生和發(fā)展［20-22］。實(shí)驗(yàn)圍繞鐵死亡和NLRP3炎癥小體通路上調(diào)進(jìn)而激發(fā)炎癥反應(yīng)的兩種機(jī)體反應(yīng)機(jī)制探討復(fù)方海桐皮對(duì)炎性軟骨細(xì)胞鐵死亡的干預(yù)作用，為海桐皮配伍透骨草的臨床使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，海桐皮配伍透骨草可介導(dǎo)NLRP3炎癥小體通路抑制炎性軟骨的鐵死亡。但該實(shí)驗(yàn)中海桐皮配伍透骨草發(fā)揮上述治療作用的相關(guān)成分靶點(diǎn)尚未完全明確，結(jié)合當(dāng)前研究推測(cè)復(fù)方海桐皮對(duì)炎性軟骨細(xì)胞鐵死亡的干預(yù)作用是通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑共同調(diào)控的結(jié)果，后續(xù)還需進(jìn)一步探究。

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