柴芍乳癖顆粒對乳腺增生模型大鼠血清激素水平和乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達水平的影響及其意義

楚愛景，程旭鋒，趙慧朵，王豐蓮

(河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科，河南 鄭州 136300)

乳腺增生病為乳腺常見病和多發(fā)病，是以乳房的疼痛或腫塊為主要臨床表現的一種既非腫瘤又非炎癥的良性改變，其發(fā)生與體內激素失調有關，被認為是乳腺癌癌前的1種良性病變，占女性全部疾病發(fā)病率的50%～70%，對女性的生命健康產生嚴重威脅[1-2]。乳腺增生屬于中醫(yī)學疾病乳中結核、乳癖的范圍，并認為主要病機是氣滯和痰凝引起瘀血，在乳房部相互凝結，引發(fā)乳癖的發(fā)生[3]。中藥治療乳腺增生病的歷史由來已久，柴芍乳癖顆粒由柴胡、白芍、黨參、白術、茯苓、郁金、三七、當歸、瓜蔞皮、浙貝母、王不留行、丹參和蒲公英等多味中藥組成，諸藥合用，共奏疏肝理氣、活血化瘀、散結止痛和健脾益氣之功。研究[4-6]顯示：柴芍乳癖湯能在一定程度上控制乳腺增生癥狀，可以明顯改善乳腺增生兔模型B超聲像，減輕雌兔乳腺增生程度，臨床上柴芍乳癖合劑可明顯改善乳腺增生患者的疼痛及全身伴隨癥狀，但目前尚無有關柴芍乳癖顆粒對乳腺增生組織產生影響的相關機制研究。因此，本研究通過探討柴芍乳癖顆粒對乳腺增生大鼠血清激素水平和乳腺組織中血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生成因子(bFGF)蛋白表達水平的影響，闡明其作用機制，為其進一步實驗研究以及臨床推廣提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品、試劑和主要儀器 雌性SD大鼠60只，SPF級，體質量為200～220 g，9周齡，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(鄂)2010-0009。苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司)，黃體酮和他莫昔芬片(上海復旦復華藥業(yè)有限公司)，柴芍乳癖顆粒(一方中藥配方顆粒，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供)，雌二醇(E2)、孕酮(P)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、催乳素(PRL)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、VEGF和bFGF檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。病理組織切片機(德國Sartorius 公司)，Leica DMI4000B 倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)，Jouan BR4I 高速離心機(德國Hereaus 公司)。

1.2 實驗動物分組和動物模型制備 60只大鼠隨機分為6組，每組10只：對照組，模型組，他莫昔芬組(4 mg·kg-1)，低(0.45 g·kg-1)、中(0.90 g·kg-1)和高(1.80 g·kg-1)劑量柴芍乳癖顆粒組。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水0.05 mL，常規(guī)喂養(yǎng)，其余各組大鼠均腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1，連續(xù)25 d；然后腹腔注射黃體酮注射液5 mg·kg-1，連續(xù)5 d，建立大鼠乳腺增生動物模型[5]。對照組和模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水，其他各組分別灌胃相應劑量的藥物，連續(xù)給藥8周。

1.3 大鼠乳頭直徑和高度測量 用游標卡尺精確測量大鼠第2對乳頭直徑和高度，并觀察其外觀。

1.4 血清采集和指標測定 10%水合氯醛按腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，4℃、3 000 r·min-1離心10 min，取血清，采用ELISA法檢測血清中E2、P、LH、FSH、PRL、GnRH、VEGF和bFGF的水平。

1.5 免疫組織化學法檢測大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達水平 無菌條件下，大鼠10%水合氯醛麻醉固定，摘下大鼠第2對乳房，于4%多聚甲醛固定，制作病理切片，HE染色，顯微鏡下觀察各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)表現(每組選取染色清晰的圖片并用圖像分析系統(tǒng)拍片)；免疫組織化學法：依次滴加一抗、生物素化山羊抗大鼠IgG，DAB顯色，檢測各組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF的表達情況，采用Image ProPlus 6.0軟件測量每張片子陽性蛋白染色面積的平均吸光度(A)值，以A值代表VEGF和bFGF蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠乳頭直徑和高度 對照組大鼠乳頭僅呈小米樣，柔軟，緊貼于皮膚上，乳頭高度和直徑無明顯變化；與對照組比較，模型組大鼠乳頭豎起較堅實，充血，乳頭高度和直徑明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，他莫昔芬組和低、中和高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳頭高度和直徑均明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)表現 與正常組比較，模型組大鼠乳腺組織中腺泡形狀不規(guī)則、分泌物增多、細胞明顯增生；與模型組比較，他莫昔芬組和低、中、高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳腺組織中腺泡形狀規(guī)則，分泌物減少，細胞增生程度減輕；與他莫昔芬組比較，高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳腺組織中腺泡形狀相對規(guī)則，分泌物減少，細胞增生程度減輕。見圖1(插頁四)。

表1 各組大鼠乳頭高度和乳頭直徑

Tab.1 Heights and diameters of nipples of rats in various groups (n=10,±s,l/mm)

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.

2.3 各組大鼠血清激素水平 與對照組比較，模型組大鼠血清中E2、LH、PRL和GnRH水平明顯升高(P<0.05)，P水平明顯降低(P<0.05)，而FSH 水平略升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，低、中和高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠血清中E2、LH、PRL和GnRH水平均明顯降低(P<0.05)，同時P和FSH水平明顯升高(P<0.05)，且呈現出一定的劑量依賴性；與他莫昔芬組比較，高劑量柴芍乳癖顆粒組各激素水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 各組大鼠血清中VEGF和bFGF水平 與對照組比較，模型組大鼠血清中VEGF和bFGF 水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中和高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠血清中VEGF和bFGF水平均明顯降低(P<0.05)；與陽性藥他莫昔芬組比較，中和高劑量柴芍乳癖顆粒組VEGF水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠血清中bFGF水平降低明顯(P<0.05)。 見表3。

2.5 各組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達水平 光鏡下觀察：VEGF和bFGF蛋白在大鼠乳腺組織細胞胞漿中染色為黃色和棕黃色。與對照組比較，模型組大鼠乳腺組織內VEGF和bFGF蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，他莫昔芬組和中、高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與他莫昔芬組比較，中和高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖2(插頁四)和圖3(插頁五)及表4。

表2 各組大鼠血清激素水平

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group.

表3 各組大鼠血清中VEGF和bFGF水平

Tab.3 Levels of VEGF and bFGF in serum of rats in various groups [n=10,±s,ρB/(ng·L-1)]

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group.

表4 各組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達水平

Tab.4 Expression levels of VEGF and bFGF proteins in breast tissue of rats in various groups (n=10,±s)

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group;#P<0.05 compared with tamaxifen group.

3 討 論

乳腺增生發(fā)生多因內分泌紊亂，與體內激素失調有密切關聯，尤其是雌、孕激素比例失衡。雌激素長期大量存在于乳腺組織，同時在不斷循環(huán)的月經周期中，又缺乏孕激素的有效保護作用，導致乳腺小葉腺泡、導管過度增生，引發(fā)乳腺增生[3，8-9]。

西醫(yī)認為乳腺增生與內分泌激素紊亂等有關，目前尚未有特效療法。古今乳病多歸責于肝和胃，乳腺增生屬中醫(yī)“乳癖”范疇。中醫(yī)認為乳腺增生與氣滯和精神因素有關，肝氣郁結、沖任失調、痰凝血瘀是主要病機，氣滯血不行，日久形成血瘀，久而久之形成結塊[10]。柴芍乳癖顆粒由多味中藥組成，方中柴胡、白芍及青皮疏肝理氣止痛、養(yǎng)血斂陰、散結止痛；黨參、白術、茯苓益氣健脾、利水滲濕；郁金活血止痛、行氣解郁；夏枯草消癖散結消腫，三七、當歸活血補血，瓜蔞皮、浙貝母清熱化痰、理氣寬胸；王不留行活血通經；丹參活血祛瘀止痛；蒲公英和山慈菇清熱解毒、化痰散結。諸藥合用，共奏疏肝理氣、活血化瘀、散結止痛、健脾益氣之功?，F代藥理學研究[11]顯示：當歸與柴胡對腫瘤生長具有很好的抑制效果，蒲公英與山慈菇的被證實具有抗癌功效。

PRL是由垂體遠側部的嗜酸性細胞產生的一種泌乳素，研究[12]表明：PRL具有促進乳腺生長發(fā)育和維持泌乳的作用，對下丘腦-垂體-卵巢軸可產生一定的抑制效果。乳腺作為PRL的靶器官，含有豐富的PRL受體。當血中PRL異常升高時，會對黃體期P的分泌產生抑制作用，同時刺激E2的合成，導致E2/P比例失調，對乳腺組織產生不良刺激，引發(fā)乳腺組織的過度增生[13]。GnRH是由下丘腦合成的一種十肽激素，以脈沖分泌方式到達垂體前葉，刺激垂體細胞合成、分泌FSH和LH，而LH和FSH能夠刺激E2和P的合成和分泌[14]。研究[15]顯示：VEGF和bFGF水平與乳腺增生程度呈正相關關系。研究[16-18]表明：VEGF和bFGF可以促進乳腺增生血管生成，為增生細胞生長提供營養(yǎng)物質和氧氣，并及時排泄代謝產物。靳亞慈[19]研究顯示：乳腺組織和血清中VEGF和bFGF的增多會引發(fā)乳房組織微循環(huán)障礙，VEGF和bFGF被激活后通過共同途徑促使乳腺增生病的發(fā)生。

本研究結果顯示：柴芍乳癖顆粒可明顯降低乳腺增生模型大鼠血清E2水平，升高血清P和FSH水平，調節(jié)血清E2/P比值，同時降低血清LH、PRL、GnRH、VEGF和bFGF水平，改善乳腺增生模型大鼠的內分泌激素紊亂，結合乳腺組織免疫組織化學結果，表明柴芍乳癖顆?？擅黠@降低大鼠乳腺增生組織中VEGF和bFGF蛋白表達水平，這可能是其發(fā)揮抑制和減緩乳腺增生發(fā)生發(fā)展的作用機制之一，本研究結果為紫芍乳癖顆粒在臨床廣泛應用提供了實驗依據。