細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A基因拷貝數(shù)變異及其與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

陳思澈，黨勝春

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

胰腺癌（pancreatic cancer）是現(xiàn)今社會(huì)病死率較高的消化道惡性腫瘤之一，預(yù)后極差，5年生存率不到6%[1-5]。胰腺癌的早期診斷及確診率不高，目前手術(shù)治療是最佳的治療方式，但轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率較高，所以找到一個(gè)可以判斷預(yù)后的標(biāo)記物是很有必要的。相關(guān)研究表明，胰腺癌發(fā)展的整個(gè)過(guò)程伴隨著多個(gè)基因的改變，而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）就是其中之一。CDKN2A是消化道惡性腫瘤患者體內(nèi)一個(gè)突變基因。研究[6]表明CDKN2A在胰腺癌是一個(gè)最常見(jiàn)的不良變異基因。在一些胰腺癌患者中，病情的改變已經(jīng)被證明與CDKN2A突變頻率增加相關(guān)，最明顯的是有胰腺癌發(fā)生家族史的患者[7]。所以在高危人群中，一般的變異都足以影響患者的生存率[8]。由于胰腺癌相對(duì)較低的發(fā)生率和存活率低，其發(fā)生的根本原因尚不明確，但有大量研究證明CDKN2A基因?qū)芏嗄[瘤的發(fā)生、發(fā)展有著一定程度的影響對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著一定的影響[9]。CDKN2A低表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等臨床病理特征有關(guān)，可能是一種新的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)癌癥患者的預(yù)后和臨床病理特征[10]。CDKN2A主要是產(chǎn)生一種腫瘤抑制蛋白，這是一個(gè)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑[11]。所以，通過(guò)認(rèn)識(shí)、了解這個(gè)基因的改變特點(diǎn)，有可能為胰腺癌的早期診斷及治療提供新的思路和方法。

基因拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），是導(dǎo)致人類疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一，主要是因?yàn)榛蚪M發(fā)生重排，一般指長(zhǎng)度為1 kb以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復(fù)。CDKN2A基因在胰腺癌的CNV程度較高。本研究通過(guò)TCGA及GTEx等數(shù)據(jù)庫(kù)研究胰腺癌中CDKN2A基因CNV對(duì)其表達(dá)和預(yù)后的影響，為進(jìn)一步研究CDKN2A相關(guān)信號(hào)通路在胰腺癌中的作用機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)里有關(guān)胰腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床資料，cBioPortal是TCGA的一個(gè)可視化在線數(shù)據(jù)庫(kù)，可以通過(guò)在cBioPortal（http://www.cbioportal.org）中“Pancreatic cancer（TCGA，Provisional）186 samples下載臨床數(shù)據(jù)。CNV、mRNA表達(dá)RNA Seq V2可在子數(shù)據(jù)庫(kù)分析，同時(shí)使用GEO等數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 數(shù)據(jù)分析

分析統(tǒng)計(jì)186例胰腺癌樣本中包含CDKN2A基因CNV的樣本以及未包含CDKN2A基因CNV的樣本的各項(xiàng)臨床參數(shù)，從TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)收集胰腺癌數(shù)據(jù)及其臨床資料，研究CDKN2A基因拷貝數(shù)缺失患者的臨床病理特征，利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)CNV與RNA Seq V2數(shù)據(jù)分析CDKN2A的CNV與其mRNA的表達(dá)水平的相關(guān)性。分析CDKN2A基因CNV對(duì)GGA2、MTAP、HOXC6、SLC2A1表達(dá)的影響。通過(guò)比對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)研究CDKN2A基因在正常人群與胰腺癌患者間的表達(dá)差異、CDKN2A基因CNV與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性；使用DAVID在線分析網(wǎng)站，通過(guò)對(duì)CDKN2A及其共表達(dá)基因進(jìn)行基因集富集分析，得到CDKN2A基因富集通路。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

生存分析使用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為相關(guān)結(jié)果有差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其它基因表達(dá)與CNV的相關(guān)性以及共表達(dá)蛋白的相關(guān)性使用Spearman和Pearson檢驗(yàn)，r＞0.3認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。功能分析采用Fisher檢驗(yàn)，P＜0.05為功能富集有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 CDKN2A基因CNV以及與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性

胰腺癌中C D K N 2 A基因C N V情況見(jiàn)圖1。CDKN2A基因CNV與mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（Pearson：r=0.102，Spearman：r=0.257）（圖2）。隨著CDKN2A基因CNV程度增高，其表達(dá)也隨之升高。

圖1 胰腺癌中CDKN2A基因CNV情況Figure 1 CDKN2A gene CNV in pancreatic cancers

圖2 CDKN2A基因CNV與其mRNA表達(dá)的相關(guān)性Figure 2 Correlation of CDKN2A gene CNV to its mRNA expression

2.2 CDKN2A基 因 CNV對(duì) GGA2、MTAP、HOXC6、SLC2A1表達(dá)的影響

將1 8 6例研究樣本根據(jù)有無(wú)C D K N 2 A基因CNV分為變異組與非變異組，結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)RNA Seq V2數(shù)據(jù)分析CDKN2A基因CNV對(duì)GGA2、MTAP、HOXC6、SLC2A1表達(dá)的影響，使用Studentt-test檢驗(yàn)。與非變異組相比，CDKN2A基因CNV組中HOXC6、SLC2A1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，GGA2、MTAP mRNA表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.05）（圖3）。通過(guò)相關(guān)性研究可以發(fā)現(xiàn)，CDKN2A基因與MTAP為正相關(guān)（Pearson：r=0.42，Spearman：r=0.55，P＜0.05），與其他三者相關(guān)程度較低（圖4）。

圖3 變異組與非變異組各基因mRNA表達(dá)情況Figure 3 The mRNA expressions of each studied gene in altered group and unaltered group

圖4 CDKN2A與各個(gè)基因相關(guān)性散點(diǎn)圖Figure 4 Scatter plots showing correlations of CDKN2A with related genes

2.3 CDKN2A基因在胰腺癌與正常組織中表達(dá)的差異

通過(guò)比對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)179例胰腺癌樣本及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)171例正常胰腺樣本發(fā)現(xiàn)，CDKN2A基因在胰腺癌腫瘤組織中表達(dá)明顯高于正常胰腺組織（P＜0.05）（圖5）。

2.4 CDKN2A基因CNV與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

攜帶CDKN2A基因CNV的胰腺癌患者的總生存率（OS）明顯低于不攜帶該基因CNV的胰腺癌患者（P=0.0175），CDKN2A基因CNV患者的無(wú)瘤生存率也明顯低于不攜帶該基因CNV的患者（P=0.0368）（圖6）。

圖5 CDKN2A基因在胰腺癌和正常胰腺組織中的表達(dá)Figure 5 CDKN2A gene expressions in pancreatic cancer and normal pancreatic tissues

圖6 CDKN2A基因CNV與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性Figure 6 Correlation between CDKN2A gene CNV and prognosis in patients with pancreatic cancer

2.5 CDKN2A的功能基因富集分析

通過(guò)對(duì)CDKN2A基因相關(guān)共表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，CDKN2A基因CNV與一些基因表達(dá)水平存在明顯的關(guān)聯(lián)（Pearson≥0.3或Spearman≥0.3）（表1）。通過(guò)對(duì)包括CDKN2A相關(guān)表達(dá)KEGG功能富集分析發(fā)現(xiàn)（表2），這些共表達(dá)基因的功能主要集中于一些細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的信號(hào)通路。提示CDKN2A相關(guān)共表達(dá)基因通過(guò)細(xì)胞周期通路調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

表1 CDKN2A基因相關(guān)共表達(dá)基因分析Table 1 Analysis of the coexpression genes related to CDKN2A gene

表2 CDKN2A的功能基因集富集分析Table 2 Enrichment analysis of CDKN2A functional genes

3 討 論

胰腺癌作為惡性程度較高的消化道腫瘤之一，一旦發(fā)現(xiàn)，大多達(dá)到進(jìn)展期，放化療等綜合治療對(duì)患者生存時(shí)間的改善甚微，其治療的首選方案為手術(shù)，但長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐表明，對(duì)于胰腺癌單純手術(shù)的治療效果是有限的[12]。因此，早期發(fā)現(xiàn)并診斷胰腺癌成為目前迫在眉睫的問(wèn)題。通過(guò)對(duì)胰腺癌基因的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了以前的基因研究尚不完善[13]。在過(guò)去的幾十年里，有一些分子標(biāo)志物被研究出來(lái)，作為胰腺癌早期診斷的基因標(biāo)志物[14]。CA19-9是一種黏蛋白類物質(zhì)，因?yàn)槠湓\斷胰腺癌的敏感性和特異性分別達(dá)到80.0%和86.0%，所以被廣泛應(yīng)用于胰腺癌的診斷[15]。但CA19-9還存在一些不足，其在胰腺良性疾病和非胰腺腫瘤患者的檢測(cè)中也有升高，如在胰腺炎、膽囊炎、胃癌、結(jié)直腸癌中等等[16]。而且，盡管CA19-9已經(jīng)使用幾十年，但仍缺乏定量診斷標(biāo)準(zhǔn)[17]。CEA則是一種酸性糖蛋白，可用于胰腺癌的輔助診斷，但是因其在多種癌癥，如乳腺癌、消化道腫瘤、肺癌等癌癥表達(dá)都有所升高，所以特異性并不高[18-21]。CDKN2A基因在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著不同的改變，使它對(duì)于腫瘤的密切關(guān)系與日俱增。胰腺癌患者存在CDKN2A基因突變頻率增加的情況[22]。并且胰腺癌中CDKN2A大多數(shù)的變異是基因缺失[23]，CDKN2A基因主要是通過(guò)腫瘤細(xì)胞周期抑制劑調(diào)控腫瘤進(jìn)展[24-25]。所以，通過(guò)認(rèn)識(shí)、了解這些基因的改變特點(diǎn)，有可能為胰腺癌的早期診斷及治療提供新的思路和方法。

本研究結(jié)果特異性地證實(shí)了在胰腺癌中，CDKN2A基因CNV是一種預(yù)后較差的因素。利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)CNV、RNA Seq V2數(shù)據(jù)分析CDKN2A的CNV與其mRNA的表達(dá)水平的相關(guān)性。CDKN2A基因拷貝數(shù)的變異與mRNA表達(dá)呈明顯正相關(guān)（Pearson：r=0.102，Spearman：r=0.257）。表明隨著CDKN2A基因CNV程度增高，其mRNA表達(dá)也隨之升高。結(jié)合 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)RNA Seq V2數(shù)據(jù)分析 CDKN2A基因CNV對(duì)GGA2、MTAP、HOXC6、SLC2A1表達(dá)的影響。CDKN2A基因CNV組中HOXC6、SLC2A1 mRNA表達(dá)水平明顯升高。GGA2、MTAP mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。而通過(guò)相關(guān)性研究可以發(fā)現(xiàn)，CDKN2A基因與MTAP為明顯正相關(guān)（Pearson：r=0.42，Spearman：r=0.55，均P＜0.05），與其他三者相關(guān)程度較低，可以得出CDKN2A很有可能使MTAP表達(dá)下降。

CDKN2A基因在腫瘤和正常組織中表達(dá)的差異，通過(guò)比對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)179例腫瘤樣本及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)171例正常樣本發(fā)現(xiàn)，CDKN2A基因在胰腺癌腫瘤組織中表達(dá)顯著高于正常組織。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)183例樣本中基因表達(dá)與臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，CDKN2A基因在各臨床分期中表達(dá)無(wú)顯著差異。CDKN2A基因CNV水平與OS顯著相關(guān)（P=0.0175），攜帶CDKN2A基因CNV的胰腺癌患者預(yù)后明顯差于不攜帶該基因CNV的胰腺癌患者。另外CDKN2A基因CNV患者的無(wú)瘤生存期顯著短于不攜帶該基因CNV的患者（P=0.0368）。表明CDKN2A變異提示預(yù)后不良，患者總生存期和無(wú)瘤生存期顯著縮短。通過(guò)對(duì)CDKN2A及其共表達(dá)基因KEGG 功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些共表達(dá)基因的功能主要集中于一些細(xì)胞周期的信號(hào)通路，提示CDKN2A相關(guān)共表達(dá)基因通過(guò)細(xì)胞周期通路調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究依托TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)胰腺癌患者進(jìn)行大樣本量的數(shù)據(jù)分析和臨床資料對(duì)比分析，探討CDKN2A CNV對(duì)患者預(yù)后的影響。通過(guò)了解基因CNV的程度，可確定CDKN2A基因可作為胰腺癌預(yù)后評(píng)估的重要分子標(biāo)志物。