浦口區(qū)草魚、鯽魚致病菌的分離鑒定和耐藥性分析

張仁展，蔡德森，江青松

（南京市浦口區(qū)水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 南京 211800）

浦口區(qū)共有水產(chǎn)養(yǎng)殖面積2 400 hm2，其中常規(guī)魚養(yǎng)殖分布在永寧、湯泉和星甸街道，以草魚、鯽魚為主，面積約680 hm2。每年細(xì)菌性病害對(duì)浦口區(qū)草魚和鯽魚的養(yǎng)殖都會(huì)造成一定損失，為了解致病菌的耐藥情況，從不同養(yǎng)殖地點(diǎn)采集草魚和鯽魚，分離體內(nèi)致病菌，同時(shí)進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，為全區(qū)水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的科學(xué)用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年6月—2018年10月，在各養(yǎng)殖集中區(qū)池塘共采集草魚發(fā)病樣品9個(gè)、鯽魚發(fā)病樣品26個(gè)。分別取肝、腎或脾進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)分離。

1.2 主要試劑

非苛養(yǎng)非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（API 20NE）購(gòu)自上海嘉合生物科技有限公司。藥敏板購(gòu)自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司，營(yíng)養(yǎng)瓊脂、RS瓊脂、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 菌株分離與純化

使用滅菌棉簽蘸取發(fā)病樣品肝臟、腎臟或脾臟，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)18～24 h，分離出單個(gè)菌落，并用接種環(huán)挑取單菌落，繼續(xù)劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)一步純化。

1.4 菌株致病性判斷

經(jīng)2次分離純化后的菌落，接種于脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)18～24 h，若菌落周圍出現(xiàn)清晰、透明的溶蛋白圈，則判定為具有致病性。

1.5 菌株鑒定

用接種環(huán)挑取純化后的單菌落于生理鹽水中，制成0.5 MCF的菌懸液，按操作要求將菌懸液分別接種到細(xì)菌鑒定試劑條（API 20NE）小管中，于30℃培養(yǎng)18～24 h。取試劑條與結(jié)果讀取表比對(duì)得出反應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)，通過(guò)API 20NE菌譜檢索手冊(cè)得到鑒定結(jié)果。從35個(gè)樣品中，共分離出菌株52株（2017年和2018年各分離出26株），其中嗜水氣單胞菌35株，溫和氣單胞菌8株，創(chuàng)傷弧菌4株，熒光假單胞菌1株，洋蔥伯克霍爾德菌4株。

1.6 最小抑菌濃度的測(cè)定

利用定制藥敏板（96孔板）測(cè)定恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、乳酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素、強(qiáng)力霉素共8種常見(jiàn)藥物的敏感程度（其中紅霉素和乳酸環(huán)丙沙星為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用漁藥，該文不作分析）。首先用接種環(huán)挑取純化后的單菌落于生理鹽水中，制成0.5 MCF的菌懸液，從中吸取0.2 mL加入到20 mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻，倒入經(jīng)滅菌的V形槽內(nèi)，然后用排槍移液器吸取該混合液，加入藥敏板所有的小孔中（第二列陰性對(duì)照除外），每孔0.2 mL，并在陰性對(duì)照孔中加入等量生理鹽水。蓋好試劑板，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h（必要時(shí)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間）。經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)小孔中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜水氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的感受性

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然環(huán)境中和水生動(dòng)物體內(nèi)，是一種典型的條件致病菌，可大規(guī)模引起淡水魚類皮膚潰瘍和急性出血性敗血癥[1]，是一類危害極其嚴(yán)重的水產(chǎn)動(dòng)物病原菌。35株嗜水氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物感受性測(cè)定結(jié)果如表1所示。

2.2 溫和氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的感受性

溫和氣單胞菌可引起多種魚類患細(xì)菌性敗血癥和腸道疾病[2]。8株溫和氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物感受性測(cè)定結(jié)果如表2所示。

2.3 創(chuàng)傷弧菌對(duì)抗菌藥物的感受性

創(chuàng)傷弧菌可引發(fā)水生動(dòng)物敗血癥和多種炎癥[3]。4株創(chuàng)傷弧菌對(duì)各種抗菌藥物感受性測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表1 嗜水氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的感受性

表2 溫和氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的感受性

表3 創(chuàng)傷弧菌對(duì)各種抗菌藥物的感受性

2.4 熒光假單胞菌對(duì)抗菌藥物的感受性

熒光假單胞菌是引起水生動(dòng)物赤皮等疾病的致病細(xì)菌。1株熒光氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物感受性測(cè)定結(jié)果如表4所示。

2.5 洋蔥伯克霍爾德菌對(duì)抗菌藥物的感受性

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還篩選到4株洋蔥伯克霍爾德菌，其對(duì)各種抗菌藥物感受性測(cè)定結(jié)果如表5所示。

表4 熒光假單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的感受性

表5 洋蔥伯克霍爾德菌對(duì)各種抗菌藥物的感受性

不同抗生素的藥敏試驗(yàn)敏感性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)有所不同，參照動(dòng)物源細(xì)菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（CLSI M100-S23），對(duì)藥物的敏感性及耐藥性判定范圍劃分如表6所示。依據(jù)這一劃分范圍，將所有抗菌藥物對(duì)各表中菌株的MIC值測(cè)定結(jié)果進(jìn)行判定，得出了所有菌株對(duì)各抗生素的感受性結(jié)果[4]，如表7所示。

表6 藥物的敏感性及耐藥性判定范圍劃分 μg/mL

從試驗(yàn)結(jié)果分析，采樣分離到的病原菌對(duì)不同抗生素類藥物表現(xiàn)了不同程度上的敏感性和耐藥性。其中，分離菌株對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素這2種藥物敏感率很高，均在90%以上，對(duì)強(qiáng)力霉素敏感率相對(duì)較高為75%，說(shuō)明這3種藥物對(duì)一些水生動(dòng)物病原菌有較好的抗菌效果，而分離菌株對(duì)甲砜霉素耐藥率最高，達(dá)到71.15%，這說(shuō)明甲砜霉素的抗菌效果相對(duì)較差。

表7 所有菌株對(duì)供試藥物感受性測(cè)定結(jié)果 %

如表8所示，比較2017年和2018年分離菌株的MIC加權(quán)平均值（MIC加權(quán)平均值=Σ（菌株數(shù)×對(duì)應(yīng)的MIC值）/菌株總數(shù)）[5]，可看出，恩諾沙星和硫酸新霉素的MIC加權(quán)平均值分別下降了75.21%和69.05%，表明2年內(nèi)病原菌對(duì)這兩種藥物的耐藥性降低；而甲砜霉素和氟苯尼考的MIC加權(quán)平均值分別提高了143.64%和693.59%，這表明病原菌對(duì)這兩種藥物的耐藥性顯著增強(qiáng)，尤其是氟苯尼考，這可能與現(xiàn)階段水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中頻繁使用該藥有關(guān)。

表8 分離菌株的MIC加權(quán)平均值 μg/mL

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，水產(chǎn)病原菌已對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。因此，水產(chǎn)從業(yè)者在治療細(xì)菌性疾病時(shí)，應(yīng)當(dāng)科學(xué)選擇用藥的種類和劑量，避免將同類抗菌藥物在同一個(gè)養(yǎng)殖環(huán)境下多次使用；同時(shí)也要著重加強(qiáng)水生動(dòng)物免疫系統(tǒng)建設(shè)，進(jìn)一步增強(qiáng)水生動(dòng)物自身抗病能力；此外，還應(yīng)嚴(yán)格遵守休藥期制度，多方面綜合把關(guān)才能減緩致病菌耐藥性的產(chǎn)生。