陳詩宇,王利
(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041)
惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)是一種革蘭氏陰性、需氧短桿菌,屬于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas)[1]。惡臭假單胞菌是一種具有腐化作用的細菌,廣泛分布于土壤及自然水體中[7]。惡臭假單胞菌為淡水魚的一種致病菌,常從腐敗的魚中檢出[2],嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[3]。惡臭假單胞菌可引起中華絨螯蟹爪無力[4]、雜交鲇皮膚褪色、潰爛[5]、大鯢死亡[6]、雜交鱘腸炎[7]及黑鯛腹水病[8]。惡臭假單胞菌也是一種人-禽-魚共患的病原菌[7],能夠引起鴨[9]等禽類發(fā)病并且導(dǎo)致人食物中毒[10]。1998年,李慶山[10]等首次發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌引起的食物中毒。鯽魚(Carassius auratus)為常見淡水魚,隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展,鯽魚逐漸受到許多病原菌的感染,其中惡臭假單胞菌的感染日趨嚴(yán)重。該試驗從鯽魚中分離得到菌株SY4,并進行了形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16SrDNA基因分析以及藥敏試驗等研究。這為進一步研究惡臭假單胞菌特性提供參考。
鯽魚取自四川省成都市某養(yǎng)殖場,體長18 cm,體質(zhì)量164 g。
顯微鏡購買自LEICA BME公司,恒溫培養(yǎng)箱購買自上海齊欣科學(xué)儀器科技有限公司,PCR儀購買自Eppendorf Germany公司,生化鑒定藥品、抗菌藥物紙片均購買自杭州微生物試劑有限責(zé)任公司,電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均購買自BioRAD公司,TaqMix、DL2000 DNA Marker均購買自北京天根生化科技有限公司。
取鯽魚腸道于MBS液體培養(yǎng)基(每1 000 mL MBS液體培養(yǎng)基由一水葡萄糖3.8 g、蛋白胨3.8 g、牛肉浸膏 3.8 g、淀粉 2.3 g、NaCl 3.3 g、KH2PO43.3g配成)中富集培養(yǎng)24 h,挑取培養(yǎng)的菌液,采用平板劃線法均勻的劃在MBS固體培養(yǎng)基(每1 000 mL MBS液體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂)上,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,純化傳代2~3次;挑取純化后的單菌落于MBS液體培養(yǎng)基中,置于37℃搖床中培養(yǎng)24 h,挑取菌液進行革蘭氏染色鏡檢。
采用細菌微量生化鑒定管參照《伯杰士鑒定手冊》[11]測定分離菌株SY4的生理生化特性。
用天根細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)制備得模板DNA。應(yīng)用16SrDNA通用引物,正向引物 F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTTAG-3',反向引物 R:5'- ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(50μL):2×Taq PCR mix 25 μL,引物各 1 μL,模板DNA 5μL,超純水 18μL。PCR反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性 5 min;94℃變性 30 s,54℃退火 30 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像系統(tǒng)進行拍照,并將陽性樣品送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行16 SrDNA基因測序。
將拼接序列提交至NCBI,同時利用Blast程序?qū)Ψ蛛x菌株SY4進行16SrDNA序列相似性檢索,找出相似性最高的菌種及同屬菌株作為內(nèi)群,另選其他菌種作外群。運用Clustalx 2.0軟件進行多序列比對,再利用Mega 5.0軟件,運用Neighbour-Joining方法,自舉1 000次構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。
采用標(biāo)準(zhǔn)Kirby-Bauer紙片擴散的方法,對分離菌株SY4進行諾氟沙星、慶大霉素等11種常用抗生素的敏感性檢測,并根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI/NCCLS)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。
分離菌在MBS固體培養(yǎng)基上長出大小均一的菌落??捎^察到黃色、光滑、不透明的菌落。革蘭氏染色觀察為革蘭氏陰性菌,呈短棒狀,如圖1。
圖1 革蘭氏染色形態(tài)圖(400×)
經(jīng)鑒定管反應(yīng)測定了SY4菌株的理化特性,結(jié)果見表1,理化指標(biāo)初步確定SY4菌株為惡臭假單胞菌。
表1 SY4的生理生化特征
以菌株SY4 DNA為模板,采用16SrDNA通用引物進行PCR擴增,得到產(chǎn)物的長度約為1 500 bp(圖2),實際測序結(jié)果為1 424 bp。將此序列提交至NCBI(登陸號:MH142393),用 Blast程序進行比對分析,得出SY4菌株與NCBI中的惡臭假單胞菌屬的相似性最高。
圖2 16SrDNA PCR擴增結(jié)果
將菌株的16 SrDNA基因序列與NCBI中已有序列進行Blast比對,結(jié)果顯示SY4菌株與假單胞菌屬種類同源性高(99%)。選取同源性高的假單胞菌屬的16 SrDNA基因序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),結(jié)果顯示SY4菌株與惡臭假單胞桿菌(P.putida)顯著聚為一支。
圖3 SY4菌株16SrDNA基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹
藥敏試驗結(jié)果(表 2)顯示:SY4菌株對米諾環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、諾氟沙星等4種抗生素高度敏感;對多粘霉素B、頭孢曲松等2種抗生素中度敏感;對磺胺甲基異惡唑、氨芐西林、甲氧芐定、復(fù)方新諾明、舒巴坦等5種抗生素耐藥。
該研究從鯽魚中分離得到菌株SY4,通過對該菌的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分離鑒定初步判定該菌為惡臭假單胞菌。在生理生化鑒定階段,楊圓圓等[7]對雜交鱘源惡臭假單胞菌的研究中,果糖顯示為陽性,而SY4菌株的研究中,果糖顯示為陰性;楊潤德[12]等對丹頂鶴惡臭假單胞菌的研究中,枸櫞酸鹽顯示為陽性,而SY4菌株的研究中,枸櫞酸鹽顯示為陰性;在《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》[11]中的模式菌株惡臭假單胞菌對枸櫞酸鹽、葡萄糖顯示為陽性,吲哚反應(yīng)顯示為陰性,而SY4菌株對枸櫞酸鹽、葡萄糖顯示為陰性,吲哚反應(yīng)顯示為陽性。造成這種差異的原因可能是菌株的來源以及試驗的環(huán)境不同。因此,采用傳統(tǒng)的生理生化鑒定方法進行菌的準(zhǔn)確判定結(jié)果可能存在一定誤差。該方法受菌株的來源、試驗環(huán)境以及試驗操作的影響,尤其對一些不常見菌、疑難菌的鑒定也可能比較薄弱[13]。鑒于此原因,該研究還采用了以16SrDNA為基礎(chǔ)的細菌分離鑒定方法對SY4菌株的16S rDNA基因序列進行測序,經(jīng)在NCBI中比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,分離菌株SY4與惡臭假單胞菌聚在一起。因此,結(jié)合傳統(tǒng)的細菌鑒定方法和16SrDNA測序法綜合判定SY4菌株是惡臭假單胞菌,從而提高了細菌鑒定的準(zhǔn)確性。
表2 SY4菌株藥敏試驗結(jié)果
關(guān)于惡臭假單胞菌的耐藥性目前僅有少量報道。毛之娟等[14]和段亞佼等[5]報道了惡臭假單胞菌對卡那霉素和諾氟沙星高度敏感。該試驗中分離菌株SY4對這兩種抗生素的敏感性與之相同。但是楊圓圓等[7]研究的結(jié)果顯示:惡臭假單胞菌對卡那霉素和諾氟沙星中度敏感,該研究結(jié)果與之不同,原因可能是菌株來源,地理環(huán)境及用藥情況等不同。根據(jù)分離菌株SY4對抗生素敏感性的研究結(jié)果,高度敏感抗生素中的故米諾環(huán)素、慶大霉素等都可作為預(yù)防和治療惡臭假單胞菌的推薦用藥。但相關(guān)研究表明,隨著廣譜抗生素的廣泛使用,惡臭假單胞菌的耐藥性越來越強,使得對惡臭假單胞菌的治療更加困難[15]。因此,通過益生菌調(diào)節(jié)魚類腸道微生物的種群數(shù)量可能是預(yù)防和治療該病的策略之一。