CYP2C19基因多態(tài)性與首發(fā)缺血性卒中氯吡格雷二級預防復發(fā)風險的關(guān)聯(lián)研究

曾濤，肖旋浩，徐邦牢，雷秀霞，李澤，周進，黃翚，潘小平

氯吡格雷是缺血性卒中二級預防的推薦抗血小板用藥。作為一種前體藥物，氯吡格雷必須經(jīng)過肝細胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）才能代謝成為活性產(chǎn)物，發(fā)揮抗血小板聚集的作用，其中CYP2C19發(fā)揮著最為重要的作用。研究證明，CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷的血小板抑制程度密切相關(guān)，快代謝（extensive metabolizer，EM）型人群的血小板抑制率要高于中代謝（intermediate metabolizer，IM）型和慢代謝（poor metabolizer，PM）型人群[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，我國不同地區(qū)和不同種族間CYP2C19基因多態(tài)性的分布有差異，廣州地區(qū)老年漢族人群以中快代謝型為主，可能影響氯吡格雷的療效，從而引起卒中復發(fā)[1-2]。本研究擬在漢族首次缺血性卒中患者中，探討規(guī)律服用氯吡格雷進行缺血性卒中二級預防卒中復發(fā)風險與CYP2C19基因多態(tài)性的關(guān)系。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 連續(xù)入組2013年8月-2015年8月于廣州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)科住院治療的急性缺血性卒中患者。納入標準：①發(fā)病1周內(nèi)，經(jīng)頭顱計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）證實有新發(fā)病灶，符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》中缺血性卒中診斷標準[3]；②首次發(fā)病，既往無缺血性卒中病史；③漢族患者；④急性卒中治療低分子肝素試驗（Trial of Org 10 172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型為大動脈粥樣硬化性腦梗死或小動脈閉塞性腦梗死類型，經(jīng)臨床判斷適合應用氯吡格雷治療進行二級預防的患者[4]。排除標準：①有凝血功能障礙者或其他有血液疾病的患者；②有嚴重心、肝、腎臟疾病者；③既往卒中病史。該研究經(jīng)過廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

2.2 基線數(shù)據(jù) 收集入組患者的年齡、性別、TOAST分型、既往病史、吸煙（連續(xù)或累積吸煙半年以上，每日超過1支）、酗酒（每周酒精攝入超過300 mg）、此次入院后生化檢查、頸動脈狹窄和顱內(nèi)動脈狹窄情況。

既往病史包括：高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高脂血癥、高同型半胱氨酸（high-homocysteine，Hcy）血癥等；入院后生化檢查包括：膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、甘油三酯、Hcy等。頸動脈狹窄根據(jù)頸動脈超聲檢查判斷，以狹窄率50%以上為存在狹窄；顱內(nèi)動脈狹窄根據(jù)頭顱磁共振血管成像（magnetic resonance angiography，MRA）檢查判斷，以狹窄率50%以上為存在狹窄。

1.2 終點事件和隨訪方法 終點事件：出現(xiàn)缺血性卒中復發(fā)。隨訪方法：通過門診、電話隨訪等方式在患者出院后每3個月進行1次隨訪，記錄患者服藥情況、終點事件的發(fā)生以及發(fā)生時間。中途改用其他抗血小板藥物或停服氯吡格雷的患者被排除。對具體患者發(fā)生終點事件即停止隨訪，研究隨訪最終截止時間為2016年10月。

1.3CYP2C19基因檢測方法 所有研究對象均于清晨空腹采集前臂靜脈全血，置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管內(nèi)，混合均勻后吸取200 μL，根據(jù)全血DNA提取試劑盒內(nèi)說明書提取全血基因組DNA。通過CYP2C19基因檢測試劑盒（BaiO）檢測基因分型。具體如下：①聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系：19 μL反應擴增液、1 μL反應液[包含脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）酶等]和5 μL DNA模板，低速離心混勻。636、681位點的擴增分別在兩個獨立的反應管中進行。②反應條件：50 ℃ 5 min，94 ℃預變性5 min，35個循環(huán)（94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s），72 ℃延伸5 min。③雜交：按照產(chǎn)品說明書，依次加入預雜交液、雜交反應液、洗脫液、抗體液、顯色液。④結(jié)果判讀：將玻璃芯片板和雜交產(chǎn)物放入芯片識讀儀。利用ArrayDoctor軟件自動掃描、分析雜交結(jié)果。CYP2C19*1為第636位和第681位均未發(fā)生突變的野生型。CYP2C19*2為第5號外顯子681位堿基G突變?yōu)锳；CYP2C19*3則為第4號外顯子第636位堿基處G突變成A，這兩個突變都致使蛋白的合成提前終止，造成酶活性缺失。這兩個突變形成雜合或純合突變，從而呈現(xiàn)6種基因型。其中*1/*1（636GG，681GG）為快代謝型；*1/*2（636GG，681GA）、*1/*3（636GA，681GG）為中代謝型；*2/*2（636GG，681AA）、*2/*3（636GA，681GA）、*3/*3（636AA，681GG）為慢代謝型。

1.4 統(tǒng)計學處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。以Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗樣本的群體代表性。計量資料符合正態(tài)分布，用表示，計數(shù)資料采用率表示。χ2檢驗或者Fisher確切概率法比較不同代謝型、基因型及等位基因組缺血性卒中復發(fā)率的差異，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。應用單變量Logistic回歸分析對缺血性卒中危險因素及CYP2C19功能缺失（loss of function，LOF）攜帶情況與缺血性卒中復發(fā)情況進行分析，將P＜0.10的變量進行多因素Logistic回歸分析，計算比值比（odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床特點及CYP2C19基因型分布研究期間共有326例患者符合納入、排除標準，326例中失訪有10例，失訪率為3.1%，隨訪時間范圍為1～37個月，平均（14.44±5.07）個月。失訪患者與納入患者的基線數(shù)據(jù)沒有差異。其中139例規(guī)律服用氯吡格雷進行卒中二級預防的患者，男性96例，女性43例，年齡55～89歲，平均（69.43±11.95）歲，攜帶者（攜帶有CYP2C19*2及*3基因型的患者）有78例，非攜帶者有61例，攜帶者與非攜帶者間的基線數(shù)據(jù)無差異（表1）。檢出快代謝型（CYP2C19*1/*1）61例，中代謝型（CYP2C19*l/*2或*1/*3）64例，慢代謝型（CYP2C19*2/*2或*2/*3或*3/*3）14例，Handy-Weinberg平衡檢驗P=0.82（表2）。

2.2CYP2C19基因代謝型及等位基因頻率與卒中復發(fā)的關(guān)系 慢代謝型在卒中復發(fā)組有7例、非復發(fā)組有7例，頻率分別為24.14%和6.36%，以快代謝型為對照，OR值為9.17，P＜0.001。中代謝型在卒中復發(fā)組有16例、非復發(fā)組有48例，頻率分別為55.17%和43.64%，以中代謝型為對照，OR值為3.05，P=0.025（表3）。

攜帶*2（G681A）A等位基因者在卒中復發(fā)組及無復發(fā)組的頻率分別是為44.83%及23.64%，與G等位基因相比相對風險值OR為2.625，P＜0.001。攜帶*2突變雜合子（CYP2C19*1/*2、*2/*3）的患者卒中復發(fā)風險是野生型的2.82倍，P=0.026。而攜帶*2突變的純合子（CYP2C19*2/*2）的患者卒中復發(fā)風險是野生型者9.69倍，P＜0.001。攜帶*3（G636A）A等位基因者與野生型G等位基因比較，卒中復發(fā)風險的差異無統(tǒng)計學意義（表4）。

2.3 卒中危險因素及CYP2C19失功能等位基因數(shù)與卒中復發(fā)風險的關(guān)系 單變量邏輯回歸分析對缺血性卒中危險因素及CYP2C19LOF等位基因攜帶數(shù)與卒中復發(fā)情況進行分析，發(fā)現(xiàn)LOF等位基因攜帶數(shù)與卒中復發(fā)存在相關(guān)（表5）。多因素二元邏輯回歸分析發(fā)現(xiàn)LOF等位基因攜帶數(shù)與卒中復發(fā)相關(guān)，攜帶有1個失功能等位基因者卒中復發(fā)的風險是未攜帶者的3.02倍，95%CI1.13～8.05，P=0.030，攜帶2個LOF等位基因者卒中復發(fā)的風險是未攜帶者的11.01倍，95%CI2.67～45.24，P＜0.001。

表1 研究對象的基線數(shù)據(jù)

表2 CYP2C19基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗

表3 CYP2C19基因代謝型與卒中復發(fā)風險的關(guān)系

3 討論

本研究共納入了139例規(guī)律服用氯吡格雷進行卒中二級預防的首發(fā)缺血性卒中患者，發(fā)現(xiàn)攜帶CYP2C19LOF等位基因的患者缺血性卒中復發(fā)的概率高于非攜帶者，且具有基因劑量效應，表現(xiàn)為攜帶2個LOF等位基因的患者卒中復發(fā)的發(fā)生率最高。多因素的二元邏輯回歸分析顯示，攜帶CYP2C19LOF等位基因是首次缺血性卒中患者氯吡格雷治療后卒中復發(fā)的獨立危險因素。攜帶1個LOF和攜帶2個LOF等位基因卒中復發(fā)分別是非攜帶者的3.02倍和10.99倍。

表4 CYP2C19基因型及等位基因頻率與卒中復發(fā)風險的關(guān)系

表5 卒中危險因素的單因素回歸分析

目前國內(nèi)外研究均證實，CYP2C19基因突變與氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）關(guān)系密切，但大多數(shù)研究集中于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的研究中，CYP2C19基因多態(tài)性與卒中相關(guān)性的研究相對較少，且結(jié)論不一[5]。在一項納入625例急性缺血性卒中患者服用氯吡格雷進行卒中二級預防的研究中，經(jīng)過為期3個月的隨訪后發(fā)現(xiàn)，攜帶有CYP2C19*2/*3變異的LOF等位基因的患者較非攜帶者出現(xiàn)復合血管事件（包括血管性死亡、非致命性缺血性卒中、非致命性心肌梗死）的風險升高[6]。Ling Fang等[7]的研究也得出了類似的結(jié)果，攜帶有2個CYP2C19LOF等位基因的急性卒中患者出現(xiàn)卒中復發(fā)的概率是非攜帶者的4.17倍（95%CI1.18～18.80，P＜0.05）。最近王擁軍團隊[8]關(guān)于CYP2C19LOF等位基因和氯吡格雷降低小卒中或短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）患者風險關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，使用氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林抗血小板治療僅能減少非攜帶者新發(fā)卒中的風險。以上研究結(jié)果表明，CYP2C19基因型在預防卒中復發(fā)中扮演著重要角色，攜帶CYP2C19LOF等位基因是卒中復發(fā)的危險因素，與本研究的結(jié)果一致。

同時，有的研究并未得到陽性的結(jié)果。在Jia Dong M等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，以血小板聚集功能為標準的實驗室檢測發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因型與CR相關(guān)，是缺血性卒中患者CR的一個獨立的預測因子，且以改良Rankin量表（modified Rankin scale，mRS）評分評估的預后分析發(fā)現(xiàn)，CYP2C19*2、*3等位基因攜帶者較非攜帶者的臨床轉(zhuǎn)歸差。但對于卒中復發(fā)統(tǒng)計分析，未發(fā)現(xiàn)卒中復發(fā)與CYP2C19相關(guān)，這可能與該研究的卒中復發(fā)率低有關(guān)（2.32%）。同樣的，在Li Na Qiu等[10]的研究中也發(fā)現(xiàn)CYP2C19基因與氯吡格雷的反應密切相關(guān)，但CYP2C19基因型與卒中復發(fā)相關(guān)性的研究中，同樣未得出陽性結(jié)果。這說明，即使通過血小板功能檢測發(fā)現(xiàn)存在有氯吡格雷生化抵抗，并不能等同于發(fā)生臨床抵抗，這除了與影響卒中發(fā)生的因素眾多有關(guān)外，也與血小板激活對卒中的病理生理過程的影響并不如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病大有關(guān)[11]。而這也是本研究的納入對象為首發(fā)缺血性卒中患者的原因，以盡可能減少潛在的干擾因素。

在本研究中，攜帶有CYP2C19LOF等位基因的患者占56.12%，與既往的報道相似，遠高于白色人種和黑色人種[12]。我國是卒中大國，每年有大約300萬新發(fā)卒中患者，而根據(jù)中國卒中登記調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，缺血性卒中患者在發(fā)病后6個月內(nèi)的復發(fā)率高達16%。因此，研究CYP2C19基因多態(tài)性與卒中復發(fā)之間的關(guān)系，對于降低卒中復發(fā)風險意義重大。根據(jù)本研究結(jié)果，完善卒中患者的CYP2C19基因多態(tài)性篩查對于指導臨床個體化的抗血小板治療是有意義的。而根據(jù)CYP2C19的基因型，調(diào)整抗血小板藥物治療，如加大藥物劑量、聯(lián)合用藥或者使用新型的抗血小板藥物（替格瑞洛、普拉格雷等）可能是潛在的解決CR的方法，但尚未得到充分的評估[13]。而根據(jù)血小板功能檢測結(jié)果調(diào)整抗血小板藥物劑量，對于改善患者預后似乎也無益處。最近法國35家中心參與，開放標簽、盲法終點的正常劑量和個體化劑量普拉格雷降低老年（＞75歲）患者支架治療后出血、支架血栓形成和缺血并發(fā)癥（Assessment of a Normal Versus Tailored Dose of Prasugrel After Stenting in Patients Aged ＞75 Years to Reduce the Composite of Bleeding，Stent Thrombosis and Ischemic Complications，ANTARCTIC）研究結(jié)果顯示，根據(jù)血小板功能監(jiān)測調(diào)整抗血小板藥物劑量不能改善急性冠狀動脈綜合征需要冠狀動脈支架手術(shù)老年患者的臨床預后[14]。目前尚未有針對卒中患者的相關(guān)研究。

本研究存在以下不足，一是本研究的對象主要為廣州本地漢族人群，且僅檢測了CYP2C19基因最為常見的CYP2C19*1/*2/*3等位基因。二是樣本量相對較小。根據(jù)目前的研究結(jié)果，攜帶有CYP2C19LOF等位基因是缺血性卒中患者氯吡格雷治療后卒中復發(fā)的獨立危險因素，但對于攜帶有CYP2C19LOF等位基因的缺血性卒中患者抗血小板治療方案調(diào)整，尚需更多的研究。

【點睛】本研究顯示，在校正其他因素后，攜帶CYP2C19失功能等位基因是規(guī)律服用氯吡格雷的首次缺血性卒中患者缺血性卒中復發(fā)的危險因素。