白玉菇液體培養(yǎng)狀況的測(cè)定

姚 堯，任玉合，任桂梅，2，王延峰，2*，賀曉龍，2

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000）

白玉菇液體培養(yǎng)狀況的測(cè)定

姚 堯1，任玉合1，任桂梅1，2，王延峰1，2*，賀曉龍1，2

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000）

為了對(duì)白玉菇液體培養(yǎng)終點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，本論文主要采用培養(yǎng)過(guò)程中的菌絲球數(shù)量、pH、還原糖和菌絲干重等指標(biāo)，對(duì)白玉菇液體培養(yǎng)的終點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)液的pH為5.38，還原糖含量是3.87時(shí)，菌絲球的數(shù)量與活性最高，并且菌絲得率最高，此時(shí)也是白玉菇液體培養(yǎng)的終點(diǎn)，相比較于固體原種的培養(yǎng)周期縮短了5～10d。

白玉菇；液體菌種；還原糖；pH；菌球數(shù)

近年來(lái)，隨著人們的生活水平的不斷提高，食用菌作為新的綠色營(yíng)養(yǎng)保健食品受到廣大消費(fèi)者的青睞，消費(fèi)需求在不斷得擴(kuò)大，可見(jiàn)食用菌產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一個(gè)重要產(chǎn)業(yè)［1］。

白玉菇（Hypsizigusmarmoreus）屬于傘菌目、口蘑科、白蘑屬，是北溫帶地質(zhì)優(yōu)良的珍稀食用菌。白玉菇的蛋白質(zhì)含量比一般蔬菜的含量高，必需氨基酸比例合適，并且含有大量多糖和各種維生素以及多種微量元素等人體必需物質(zhì)，白玉菇在液體培養(yǎng)過(guò)程中還能產(chǎn)生多糖、多肽、生物堿、萜類(lèi)化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、維生素、植物激素等多種生理活性物質(zhì)［2］。

隨著白玉菇逐漸進(jìn)入大眾眼球，國(guó)內(nèi)出現(xiàn)了大量的針對(duì)白玉菇生物特性、栽培條件等方面的研究，而在液體培養(yǎng)方面的研究則相對(duì)較少［3］。目前白玉菇液體培養(yǎng)的技術(shù)相對(duì)落后，檢測(cè)手段單一，難以監(jiān)控白玉菇液體培養(yǎng)的整個(gè)環(huán)節(jié)，因此利用液體培養(yǎng)發(fā)展白玉菇則少之又少。而本試驗(yàn)則通過(guò)對(duì)白玉菇液體培養(yǎng)過(guò)程中不同物質(zhì)的含量變化來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)狀況，豐富和加強(qiáng)了檢測(cè)手段，從而對(duì)發(fā)展白玉菇液體培養(yǎng)代謝產(chǎn)物和液體制種提供準(zhǔn)確的試驗(yàn)參考，為白玉菇工廠化提供廣闊的研究前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥品及菌種

瓊脂粉，葡萄糖，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，維生素B1，維生素B2，氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉，3，5－二硝基水楊酸，等。

白玉菇菌種（延安大學(xué)生命科學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)，UV－2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，HV－110型立式壓力蒸汽滅菌器，101－3型電熱鼓風(fēng)干燥箱，ZJS－1320氣浴式振蕩器，MP200A型電子天平，HHS－25C型pH計(jì)，KDC－160HR型高速冷凍離心機(jī)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱等實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。

2 主要實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基配方

母種培養(yǎng)基配方：葡萄糖20g，馬鈴薯200g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B12片，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，常規(guī)技術(shù)制備［4］。

液體培養(yǎng)基配方：土豆200g煮汁1000mL，玉米粉15 g，葡萄糖15 g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5 g，維生素B10.1mg，維生素B20.5 mg。

2.2 液體培養(yǎng)方法與測(cè)定

2.2.1 液體培養(yǎng)方法

將液體培養(yǎng)基裝入150mL的三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝入50mL，在121℃、0.12MPa壓力下滅菌30min，冷卻后進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，確認(rèn)無(wú)菌后在超凈工作臺(tái)中采用無(wú)菌技術(shù)給每個(gè)三角瓶中接入培養(yǎng)了7 d的斜面活化的3塊1cm2菌種，靜置1d后在230r／ min搖床培養(yǎng)1d作為試驗(yàn)前培養(yǎng)。而后在180r／min的搖床開(kāi)始培養(yǎng)9 d，培養(yǎng)溫度為25℃，每天取3瓶檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)［5］，結(jié)果取其平均值，繪制圖表。

2.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取9支規(guī)格大小相同具塞刻度試管，編號(hào)，按表1操作，然后將各管搖勻，同時(shí)置于沸水浴中，準(zhǔn)確加熱5 min（必須嚴(yán)格控制反應(yīng)過(guò)程的溫度和加熱時(shí)間），取出后立即用冷水冷卻到室溫，加蒸餾水21.5 mL，混勻。用UV－2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540nm處以0號(hào)管為對(duì)照，分別測(cè)定其余各管吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1［6］。

表1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線配制表

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 指標(biāo)測(cè)定

菌球計(jì)數(shù)：利用培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)兩種方法綜合計(jì)數(shù)。培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)：吸取1mL培養(yǎng)基稀釋10mL，取1mL稀釋液置培養(yǎng)皿中，皿下襯黑白相間方格紙計(jì)數(shù)［7］。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)：吸取1mL培養(yǎng)基稀釋10mL搖勻，取200μL置于血球計(jì)數(shù)板中，在10倍光鏡下觀察計(jì)數(shù)。

pH值測(cè)定：用pH計(jì)測(cè)量培養(yǎng)液中部的pH值。

還原糖測(cè)定：用3，5－二硝基水楊酸法檢測(cè)液體中還原糖含量。

菌絲干重：抽濾后的菌絲球用蒸餾水反復(fù)多次沖洗，置于60℃烘箱中烘至恒重后稱其重［8］。

3 結(jié)果與討論

3.1 液體培養(yǎng)菌絲球數(shù)量

對(duì)于菌絲球的生長(zhǎng)變化，采用血球計(jì)數(shù)板法和培養(yǎng)皿法相結(jié)合的的測(cè)定方法來(lái)計(jì)算培養(yǎng)液中菌絲球的數(shù)量，以1d為測(cè)定周期，密切觀察菌絲的生長(zhǎng)情況和菌絲球的形態(tài)數(shù)量變化，結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 白玉菇菌絲數(shù)量變化圖

結(jié)合圖2和圖3綜合比較可以得出，在開(kāi)始培養(yǎng)的1～2d中，由于菌絲處在一個(gè)短暫的修復(fù)期和適應(yīng)期里，所以菌絲球的生長(zhǎng)活力比較低，菌絲球數(shù)量基本無(wú)變化；培養(yǎng)3 d以后，菌絲的活力開(kāi)始恢復(fù)，菌絲球的數(shù)量也出現(xiàn)了指數(shù)增長(zhǎng)，在第6～7 d的時(shí)菌絲球的活力最旺盛，菌絲球的數(shù)量也增長(zhǎng)到最高值；之后由于菌絲數(shù)量過(guò)多，培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)持續(xù)減少，菌絲數(shù)量由盛轉(zhuǎn)衰，數(shù)量開(kāi)始急劇減少，活力開(kāi)始降低，菌絲質(zhì)量也變差。而這種菌絲球數(shù)量曲線與白玉菇的生長(zhǎng)曲線基本相同。

圖3 白玉菇菌絲球數(shù)量變化圖

3.2 培養(yǎng)液pH值

白玉菇pH值變化，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 白玉菇pH值變化圖

從圖4可以看出，在培養(yǎng)期間液體的pH變化很小，基本上保持不變，從整個(gè)培養(yǎng)周期來(lái)看，略有上升。這是因?yàn)榘子窆揭后w培養(yǎng)初期菌絲分級(jí)機(jī)制產(chǎn)生部分有機(jī)酸，在后期菌絲球老化姿容產(chǎn)生堿性物質(zhì)，是培養(yǎng)液的pH略微升高。而如果培養(yǎng)液的pH持續(xù)走低，培養(yǎng)液渾濁或者氣味變化較大，基本可以認(rèn)定為雜菌污染。

3.3 培養(yǎng)液還原糖

白玉菇還原糖變化趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

通過(guò)圖5可以看出，培養(yǎng)液中的還原糖總體含量是下降的，第1—3天為菌絲快速生長(zhǎng)，消耗大量的還原糖，第3—6天還原糖的含量基本保持穩(wěn)定，菌絲產(chǎn)生的還原糖與消耗的基本相同，處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中。第7天以后還原糖含量又開(kāi)始下降，這是由于菌絲開(kāi)始老化死亡，產(chǎn)生得少，而消耗得多。因此，根據(jù)還原糖的變化曲線，我們可以將第6—7天作為培養(yǎng)終點(diǎn)。

3.4 菌絲干重

白玉菇菌絲干重變化，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 白玉菇菌絲干重變化圖

根據(jù)圖6所示，菌絲重量總體是增加的，第1～3 d菌絲重量開(kāi)始增加，但幅度很小，第4～6 d為菌絲生長(zhǎng)的旺盛階段，菌絲重量不斷增加，第7 d菌絲重量達(dá)到最大，之后菌絲重量開(kāi)始減少，這與菌絲球數(shù)量關(guān)系基本相符合。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)白玉菇液體培養(yǎng)過(guò)程中的菌絲球數(shù)量、pH、還原糖和菌絲干重等相關(guān)數(shù)據(jù)的測(cè)定，基本繪制出了白玉菇液體培養(yǎng)周期的各生理生化的變化曲線圖，通過(guò)這些變化趨勢(shì)在不同的發(fā)酵終點(diǎn)收集不同的發(fā)酵產(chǎn)物。pH值以及還原糖含量可以作為終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)之一，但不能成為唯一標(biāo)準(zhǔn)，必須各項(xiàng)數(shù)據(jù)之間相結(jié)合，從而才能更為準(zhǔn)確、有效地獲得預(yù)期的產(chǎn)物。

因?yàn)榘子窆绞呛醚蹙?，轉(zhuǎn)速過(guò)低，溶氧不足，不能滿足白玉菇菌絲的生長(zhǎng)要求，轉(zhuǎn)速過(guò)高會(huì)損害菌絲體的生長(zhǎng)，所以采用180r／min；溫度對(duì)白玉菇的生長(zhǎng)影響也極其顯著，白玉菇的最適生長(zhǎng)溫度為25℃，比一般的食用菌的生長(zhǎng)溫度低；白玉菇的生長(zhǎng)培養(yǎng)基pH范圍比較較廣，一般采用自然pH；培養(yǎng)時(shí)間對(duì)白玉菇菌絲生長(zhǎng)也有著顯著的影響，因此找出最佳的生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)于培養(yǎng)白玉菇的培養(yǎng)也是很重要的。而此次試驗(yàn)由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間以及相關(guān)器材，本論文未對(duì)白玉菇的生理生化的多數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)定，在下一階段的實(shí)驗(yàn)中會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行完善。

截至目前，查閱了相關(guān)文獻(xiàn)資料目前尚未見(jiàn)白玉菇菌絲體深層發(fā)酵方面的研究報(bào)道，國(guó)外也沒(méi)有白玉菇子實(shí)體和菌絲體成分比較全面的研究報(bào)道，這將是白玉菇一個(gè)新的研究方向。白玉菇有著長(zhǎng)遠(yuǎn)的研究前景，而我國(guó)對(duì)白玉菇的研究正處在起步階段，相信隨著研究的不斷深入，我們必將挖掘出白玉菇更多的價(jià)值。

［1］柴新義，汪美英，許雪峰，等.我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及開(kāi)發(fā)策略［J］.資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng)，2006（4）：27－28.

［2］鄧超，鄔敏辰.食用菌深層發(fā)酵及其多糖活性研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（15）：128－130.

［3］Mihall JD.Bruhn N.Bonello P.Spatial and temporal patterns ofmorel fruiting［J］.Mycological Research，2007，111（3）：339－346.

［4］張樹(shù)庭，Miles PG.食用蕈菌及其栽培［M］.河北：河北大學(xué)出版社，1992，11－12.

［5］魏群.基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京：高等教育出版社，2009，7

［6］張甫安，蔣筱仙，王鏞濤.食用菌制種指南［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1992，11.

［7］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，1997，7.

［8］王宜磊，趙良田.彩絨革蓋菌多酚氧化酶活性研究［J］.植物學(xué)通報(bào)，1999，16（4）：454－456.

［責(zé)任編輯 李曉霞］

Determ ination of Hypsizigus Marmoreus Using Liquid Cultivation Situation

YAO YAO1，REN Yu-he1，REN Gui-mei1，2WANG Yan-feng1，2*，HE Xiao-long1，2
（1.College of Life Science，Yanan University；2.Shaanxi Engineering and Technological Research Center for Conversation and Utilization of Regional Biological Resources，Yanan 716000，China）

In order to determine the cultivation terminal point of Hypsizigusmarmoreus this thesismainly uses index of the quantity of bulb forms，pH，reduction sugar and dry weight of the turf course of in the cultivation.The result shows that bulb formswill have the supreme amount and active hyphae and have a highest rate of turf gainingwhen the pH of cultivation liquid is 5.38，the content of reduction sugar is 3.870，at this time，this is also the terminal point of the Hypsizigusmarmoreus；compared with the solid＇s original seeds，its cultivation period shortens 5～10days.

hypsizigusmarmoreus；liquid spawn；reducing sugar；pH；bacteria the count

Q935；S567.39

A

1004－602X（2014）04－0092－04

10.3969／J.ISSN.1004－602X.2014.04.092

2014-10-18

陜西省高水平大學(xué)建設(shè)項(xiàng)目（2012SXTS06）；陜西省科學(xué)技術(shù)農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（2011K02－11）；陜西省2014年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（1097）；延安市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011KG－15）

姚 堯（1989—），男，陜西丹鳳人，延安大學(xué)在讀碩士研究生。*通訊作者