綜合設(shè)計性實驗在病理生理學(xué)教學(xué)中的實踐與評價
——觀察限制性液體復(fù)蘇對休克腸I/R損傷的保護(hù)作用

袁文丹，李小辰，張 穎，馬 月，毛慧琳，楊程程

（濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003）

學(xué)生綜合設(shè)計性實驗是對傳統(tǒng)的實驗進(jìn)行的一項教學(xué)改革，是依托機(jī)能學(xué)開放實驗室開設(shè)的綜合設(shè)計性實驗。本綜合設(shè)計性實驗的創(chuàng)新點是在原來病理生理學(xué)家兔休克實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計的，觀察限制性液體復(fù)蘇對失血性休克腸缺血再灌注（I/R）的影響及治療作用。本綜合設(shè)計性實驗訓(xùn)練了學(xué)生綜合運(yùn)用知識的能力，并探討腸I/R復(fù)蘇治療的作用及預(yù)后，提高了學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題的能力。

1 實驗的思路和方法

1.1 學(xué)生自主設(shè)計實驗方案

實驗教師提前1~2周給出實驗?zāi)康模v解實驗的有關(guān)要求，進(jìn)行分組；學(xué)生通過上網(wǎng)查閱大量文獻(xiàn)自行設(shè)計實驗方案[1]，內(nèi)容包括實驗?zāi)康暮驮怼⑺璧膭游锖推鞑?、主要的實驗步驟和方法、預(yù)期的結(jié)果等。學(xué)生在課堂上對獲得的知識加以概括、分析、綜合，經(jīng)小組內(nèi)部討論后參與班上的討論，確定實驗方案。如學(xué)生自主設(shè)計方案之一：“研究限制性液體復(fù)蘇方式對失血性休克腸I/R的影響，并評價效果、估計預(yù)后?！痹搶嶒灥膭?chuàng)新點之一是：探討不同液體復(fù)蘇方式對腸I/R損傷的影響及可能導(dǎo)致多系統(tǒng)器官功能障礙（MODS）的機(jī)制。本實驗創(chuàng)新點之二是：學(xué)生針對腸I/R損傷，科學(xué)合理地設(shè)計觀察指標(biāo)，如觀察自由基脂質(zhì)過氧化損傷產(chǎn)生的腸丙二醛（MDA）含量、血漿中MDA含量、堿剩余（BE）及內(nèi)毒素（LPS）水平，為腸I/R損傷機(jī)制研究及預(yù)后提供了實驗依據(jù)。

1.1.1 實驗?zāi)康暮驮?休克后腸黏膜I/R損傷是導(dǎo)致MODS的重要基礎(chǔ)和中心環(huán)節(jié)，因此減少腸黏膜I/R損傷是減少全身炎癥反應(yīng)（SIRS）的發(fā)生及阻止休克轉(zhuǎn)化為MODS的關(guān)鍵。本實驗通過建立失血性休克動物模型，觀察不同液體復(fù)蘇狀態(tài)下小腸黏膜I/R損傷程度，檢測腸組織MDA含量、血漿中MDA含量、堿剩余及內(nèi)毒素水平的變化，探討復(fù)蘇治療作用及估計預(yù)后，為臨床實踐提供進(jìn)一步的理論和實驗依據(jù)。

1.1.2 實驗方法和步驟 方法：家兔24只，隨機(jī)分為假休克組、限制補(bǔ)液組、常規(guī)補(bǔ)液組、休克未治療組，每組6只。假休克組動物僅穿刺頸動脈、頸靜脈，給予插管但不放血。其他3組動物進(jìn)行頸動、靜脈插管，連接血壓記錄儀，然后從頸動脈放血，使血壓降至40~50 mmHg，接著根據(jù)血壓的變化放出或回輸少量血液，使血壓繼續(xù)維持在40~50 mmHg之間，并且觀察30分鐘。在制作休克模型成功后，限制補(bǔ)液組、常規(guī)補(bǔ)液組分別經(jīng)頸靜脈輸入林格氏液，血壓分別維持在60~70 mmHg和90~120 mmHg；而休克未治療組不輸入任何液體。在治療60分鐘后，除假休克組外，均用乳酸林格氏液與抗凝的全血按2∶1的體積比進(jìn)行充分復(fù)蘇，并繼續(xù)維持大鼠血壓在休克前水平，持續(xù)60分鐘。4組均于治療開始的0分鐘、60分鐘、120分鐘分別取腸系膜上靜脈血1 ml，然后測定血漿MDA、BE、LPS含量，并于實驗120分鐘時處死動物，無菌操作下開腹，距回腸瓣5 cm處取回腸4 cm，生理鹽水洗凈，組織勻漿，測定腸組織MDA含量。另外，腸組織用10%甲醛固定，常規(guī)取材制片，HE以及PAS染色，光鏡下觀察病理變化。

1.2 學(xué)生獨立完成實驗

本實驗方案在教師指導(dǎo)下，教師和學(xué)生一起對其科學(xué)性、創(chuàng)新性、可行性進(jìn)行了討論，實驗由學(xué)生獨立完成，既培養(yǎng)了嚴(yán)謹(jǐn)求實的學(xué)風(fēng)，又培養(yǎng)了學(xué)生的動手能力和創(chuàng)新能力。

1.2.2 實驗結(jié)果（部分結(jié)果如下）（1）失血性休克時，缺血再灌注損傷導(dǎo)致腸黏膜損傷加重，液體復(fù)蘇后家兔血漿中及腸道組織勻漿中MDA水平升高，血BE負(fù)值增大，LPS含量增加，說明腸道組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷及酸中毒損傷，與常規(guī)補(bǔ)液組比較，限制補(bǔ)液組能顯著改善上述改變（P<0.05），見表1。

表1 不同液體復(fù)蘇方式治療60分鐘時血漿MDA含量、BE值、LPS 含量±s）

表1 不同液體復(fù)蘇方式治療60分鐘時血漿MDA含量、BE值、LPS 含量±s）

注：與假休克組、休克未治療組比較，*P<0.05；與常規(guī)補(bǔ)液組比較，#P<0.05

組別假休克組限制補(bǔ)液組常規(guī)補(bǔ)液組休克未治療組LPS（EU/mL）0.178±0.028 0.467±0.066#0.788±0.076*1.535±0.123血壓（mmHg）90~120 60~70 90~120 45~55 MDA（nmol/L）13.07±0.32 12.03±0.61#15.40±0.54*24.07±0.92 BE（mmol/L）-0.41±2.53-1.41±2.19#-3.41±3.21*-5.41±3.35

（2）光鏡下見：假休克組小腸絨毛結(jié)構(gòu)正常；休克未治療組小腸絨毛結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，局部組織壞死脫落，黏膜厚度及絨毛高度明顯降低，黏膜下層血管擴(kuò)張充血、大量炎性細(xì)胞浸潤；常規(guī)補(bǔ)液組及限制補(bǔ)液組均可見小腸絨毛結(jié)構(gòu)基本正常，小腸部分絨毛及黏膜下層疏松水腫，炎性細(xì)胞浸潤，有少量滲出物，與常規(guī)補(bǔ)液組比較，限制補(bǔ)液組小腸黏膜厚度及絨毛高度變化較?。≒<0.05），見表 2。

1.3 實驗討論

通過實驗，使學(xué)生掌握了科研設(shè)計的基本原則和科研工作的基本思路。失血性休克是創(chuàng)傷及外科手術(shù)中較常見的合并癥，腸道是失血性休克后損傷的重要靶器官，腸道可發(fā)生細(xì)菌易位[2]。易位的細(xì)菌產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素（LPS）并釋放至血液，發(fā)生內(nèi)毒素血癥，并激活炎癥細(xì)胞，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，因此腸道又是SIRS（全身炎癥反應(yīng)綜合征）的啟動器官。近年來，腸I/R損傷發(fā)生及防治措施的研究越來越受到重視，但其發(fā)生機(jī)制目前尚不完全清楚。在本實驗中，小腸黏膜承受失血性休克低灌注、缺氧產(chǎn)生酸中毒及輸液后腸I/R三重?fù)p傷，可導(dǎo)致腸黏膜通透性增加、屏障破壞、自由基損傷，不僅如此，休克時腸道屏障功能下降，腸道炎癥反應(yīng)在休克復(fù)蘇后仍可持續(xù)存在，也是發(fā)生MODS的重要原因。而休克復(fù)蘇過程治療不當(dāng)在一定程度上加重I/R損傷。已有大量證據(jù)表明，氧自由基損傷是早期缺血再灌注損傷的重要機(jī)制[3]。因此，休克發(fā)生后，減少腸黏膜缺血再灌注導(dǎo)致的氧自由基損傷，保護(hù)腸黏膜屏障是減少SIRS發(fā)生及阻止休克患者轉(zhuǎn)化為MODS的關(guān)鍵。本實驗結(jié)果顯示，限制性液體復(fù)蘇治療可減少氧自由基、內(nèi)毒素的產(chǎn)生及減輕黏膜屏障的損傷程度。本實驗探討了不同治療措施與繼發(fā)SIRS及MODS之間的關(guān)系，為減少失血性休克MODS發(fā)生及預(yù)后提供一定的理論和實驗依據(jù)。

表2 不同液體復(fù)蘇治療120分鐘時腸道黏膜損傷情況（±s）

表2 不同液體復(fù)蘇治療120分鐘時腸道黏膜損傷情況（±s）

注：與假休克組、休克未治療組比較，*P<0.05；與常規(guī)補(bǔ)液組比較，#P<0.05

組別假休克組限制補(bǔ)液組常規(guī)補(bǔ)液組休克未治療組絨毛高度（μm）412.4±10.7 338.6±11.4#230.2±17.1*138.3±11.3血壓（mmHg）90~120 90~120 90~120 90~120腸 MDA（nmol/mg）0.833±0.112 2.682±0.176#4.553±0.526*7.029±0.271黏膜厚度（μm）515.7±13.5 461.5±10.7#420.1±12.3*326.2±15.5

2 學(xué)生自主實驗設(shè)計的效果評價和體會

（1）通過開設(shè)創(chuàng)新性的綜合設(shè)計性實驗，加強(qiáng)了學(xué)生對理論知識的學(xué)習(xí)、理解和記憶，使學(xué)生對病理生理學(xué)理論和實驗課產(chǎn)生了濃厚的興趣，對課堂上所學(xué)的休克、酸堿紊亂、缺血再灌注的機(jī)理及對機(jī)體的相互影響有了更深入具體的研究，并使學(xué)生掌握了通過網(wǎng)絡(luò)查閱相關(guān)知識的技能，提高了發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題的能力，由被動上課轉(zhuǎn)為了主動學(xué)習(xí)[4]。

（2）對教師的實驗教學(xué)能力提出了新的挑戰(zhàn)。學(xué)生的綜合設(shè)計性實驗要求教師不斷更新知識結(jié)構(gòu)，探索和幫助學(xué)生完善實驗方案，引導(dǎo)學(xué)生正確進(jìn)行實驗操作，順利完成實驗報告的撰寫與答辯。

（3）提高了學(xué)習(xí)興趣，為學(xué)生終身學(xué)習(xí)奠定了基礎(chǔ)。通過實驗，使學(xué)生經(jīng)歷了一次初步進(jìn)行科學(xué)研究的實踐，使之在大學(xué)時代就能感悟到科學(xué)研究的嚴(yán)謹(jǐn)與艱苦，不僅磨煉了意志、發(fā)散了思維，還提高了其學(xué)習(xí)積極性和主動性，為學(xué)生今后從事臨床工作及科學(xué)研究工作奠定了良好的基礎(chǔ)。