黃芩對弓形蟲感染小鼠細(xì)胞免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

王海鳳，張新鵑，荊雪寧，唐賽賽

（山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺(tái) 264199）

剛地弓形蟲是一種條件致病寄生蟲，為專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，貓科動(dòng)物是其終宿主和重要的傳染源，其中間宿主包括人和哺乳類動(dòng)物等[1]。孕婦和免疫缺陷的人群（如AIDS）僅輕度感染即可引起嚴(yán)重的后果。妊娠期感染弓形蟲可影響胎兒的發(fā)育，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[2]。AIDS患者感染易導(dǎo)致弓形蟲腦病的出現(xiàn)，嚴(yán)重的極易引起死亡[3]。近年來，隨著飼養(yǎng)寵物（尤其是貓）的隊(duì)伍不斷壯大，加大了弓形蟲感染的潛在危險(xiǎn)。雖然隨著診斷方法的不斷改進(jìn)，弓形蟲的檢出率得到提高，但弓形蟲病的治療仍是當(dāng)前棘手的問題。目前臨床上治療弓形蟲病主要以西藥為主，如乙胺嘧啶、磺胺嘧啶等。雖然這些藥物對急性感染者體內(nèi)速殖子的殺滅和抑制有明顯的作用，但同時(shí)也存在較大的毒副作用。中藥是我國醫(yī)藥學(xué)的瑰寶，有毒副作用小、低殘留的優(yōu)點(diǎn)，所以越來越多的學(xué)者開始將方向聚焦于中藥治療弓形蟲病的研究。在中藥治療弓形蟲感染的實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，無論單方還是復(fù)方制劑，多數(shù)涵蓋了對黃芩的研究[4-5]。黃芩又名元芩，為唇形科植物黃芩，以根入藥。黃芩具有抗菌、抗病毒、免疫增強(qiáng)、免疫調(diào)節(jié)的作用[6-7]。通過黃芩抗弓形蟲感染的實(shí)驗(yàn)研究，明確黃芩不能起到直接的殺蟲作用[8]，但可顯著抑制弓形蟲的增殖[9-10]，從而起到抗感染的作用。弓形蟲感染后機(jī)體的免疫是以T細(xì)胞介導(dǎo)為主的細(xì)胞免疫，參與機(jī)體免疫反應(yīng)的主要有巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及其多種細(xì)胞因子[11]。為了初步研究黃芩抗弓形蟲感染是否與增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能有關(guān)，我們設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃芩 黃芩藥材購自山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，品種鑒定合格。取黃芩適量，用純水煎制成1 g/ml的溶液，供實(shí)驗(yàn)用。

1.1.2 小鼠 清潔級健康昆明雌性小鼠70只，鼠齡6～8周，重18～22 g，購自南京君科生物工程有限公司。

1.1.3 弓形蟲強(qiáng)毒株（RH株）速殖子 由山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室提供。

1.1.4 試劑 小鼠血清IL-2 ELISA檢測試劑盒，購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲蟲體準(zhǔn)備 復(fù)蘇液氮凍存蟲體，昆明小鼠腹腔接種，54小時(shí)轉(zhuǎn)種一次，共轉(zhuǎn)種3～4次，收集腹腔液內(nèi)蟲體，離心去上清，并用無菌PBS調(diào)整蟲體濃度為103/ml，嚴(yán)格無菌操作，以下操作也保證無菌進(jìn)行。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 將健康昆明雌性小鼠70只隨機(jī)分為對照組（20只）、感染組（25只）、治療組（25只）。感染組、治療組每只小鼠腹腔注射上述弓形蟲懸液0.5 ml，約含500個(gè)速殖子，對照組腹腔注射等量的無菌生理鹽水。治療組腹腔感染后4小時(shí)開始灌胃給藥（黃芩藥液），劑量為0.5 ml/鼠，灌藥量為500 mg/d，感染組、對照組給予等量的蒸餾水，灌胃前2小時(shí)禁水禁食，連續(xù)給藥7天后進(jìn)行指標(biāo)檢測。對照組、感染組、治療組小鼠存活量分別為20只、21只、24只。

1.2.3 小鼠外周血中IL-2檢測 于灌胃結(jié)束后次日對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行眼底靜脈取血，收集于0.5 ml無菌EP管中，室溫靜置1小時(shí)，3 000 r/min離心10分鐘，采用雙抗體加心法ELISA試劑盒測定小鼠外周血中IL-2細(xì)胞因子的含量，嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行操作。

1.2.4 測定小鼠脾、胸腺指數(shù) 稱取小鼠體重（g），脫臼處死后剖開胸腹腔，并分離其脾臟、胸腺，用生理鹽水清洗，濾紙吸干稱重（mg），測定脾、胸腺指數(shù)，即：胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺重量（mg）/小鼠體重（g）；脾指數(shù)（mg/g）=脾重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.2.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖功能檢測 測定小鼠脾、胸腺指數(shù)后，將小鼠脾臟勻成勻漿，用200目篩網(wǎng)過濾，制備脾細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5分鐘，棄上清，加入適量紅細(xì)胞裂解液，震蕩3分鐘，靜置10分鐘后離心（4℃，1 000 r/min）10分鐘，棄上清，用PBS洗2次，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml[12]。將上述制備的脾淋巴細(xì)胞懸液加入96孔U形培養(yǎng)板中，每孔100μl。分別加入 ConA（10 μg/ml）100 μl，使其終濃度為 5 μg/ml，每個(gè)標(biāo)本3個(gè)復(fù)孔，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加入 MTT（5 mg/ml）10 μl，培養(yǎng)結(jié)束后 1 500 r/min離心 10分鐘，小心吸去上清，加入100μl，DMSO振蕩10分鐘，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后靜置15~20分鐘，用酶標(biāo)儀550 nm檢測各孔吸光度（OD值）[13]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果，用（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠外周血清IL-2含量比較（見表1）

表 1 3 組小鼠外周血清 IL-2 含量比較（±s，pg/ml）

表 1 3 組小鼠外周血清 IL-2 含量比較（±s，pg/ml）

注：與對照組比較，#P<0.01；與感染組比較，*P<0.01

組別對照組感染組治療組鼠數(shù)20 21 24 IL-2含量38.18±2.01 40.63±2.97#48.57±3.26*

2.2 3組小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)比較（見表2）

表2 3組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)比較（±s，mg/g）

表2 3組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)比較（±s，mg/g）

注：與對照組比較，#P<0.01；與感染組比較，*P<0.01

組別對照組感染組治療組鼠數(shù)20 21 24胸腺指數(shù)1.82±0.17 1.75±0.19 2.08±0.31*脾指數(shù)3.44±0.56 3.97±0.66#4.35±0.73*

2.3 黃芩對弓形蟲感染小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（見表3）

表3 黃芩對弓形蟲感染小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（±s）

表3 黃芩對弓形蟲感染小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，#P<0.01；與感染組比較，*P<0.01

組別對照組感染組治療組鼠數(shù)20 21 24脾淋巴細(xì)胞OD值0.356±0.054 0.389±0.019#0.415±0.048*

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)研究中，通過小鼠脾、胸腺指數(shù)的測定，外周血清IL-2含量的測定及用MTT法測定脾淋巴細(xì)胞增殖情況，以初步探索黃芩在抗弓形蟲感染時(shí)對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響。在實(shí)驗(yàn)研究中，以500個(gè)速殖子作為感染劑量，既保證了感染狀態(tài)，又控制了小鼠的死亡率，有利于研究的開展[8]。

3.1 弓形蟲感染小鼠急性期，可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫

表1~3顯示，感染組與對照組相比，弓形蟲感染小鼠后可引起IL-2含量、脾指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞OD值顯著升高（P<0.01），該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與苑文英[14]的報(bào)道相一致。由此表明，在弓形蟲感染急性期，弓形蟲抗原可激活機(jī)體免疫應(yīng)答，活化T細(xì)胞，在體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，并通過效應(yīng)性T細(xì)胞或細(xì)胞因子IL-2等抑制蟲體繁殖[11，15]。

3.2 黃芩可提高弓形蟲感染小鼠外周血清IL-2含量

表1顯示，治療組與感染組相比，小鼠外周血清IL-2含量顯著升高（P<0.01），表明黃芩可提高弓形蟲感染小鼠外周血清IL-2含量。IL-2主要是由CD4+輔助T（Th）細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在小鼠體內(nèi)，只有Th1亞群可產(chǎn)生IL-2，IL-2可參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染機(jī)制的作用，特別是抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌的感染，誘導(dǎo)并增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，增強(qiáng)CTL等穿孔素的表達(dá)[16]。有研究表明，對弓形蟲感染小鼠注射一定劑量的重組IL-2，能明顯增強(qiáng)小鼠抗急性弓形蟲感染的能力，可以顯著延長小鼠的生存時(shí)間，并明顯減少慢性感染小鼠腦內(nèi)包囊的數(shù)量，肯定了IL-2在免疫應(yīng)答中抗弓形蟲感染的作用[17-18]。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩可提高弓形蟲感染小鼠外周血清IL-2的含量，可能提示黃芩可以通過促進(jìn)IL-2的分泌和釋放來提高小鼠細(xì)胞免疫功能，從而間接達(dá)到抗弓形蟲感染的作用。

3.3 黃芩可提高弓形蟲感染小鼠脾、胸腺指數(shù)

胸腺是中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞分化成熟的場所，并將成熟的T細(xì)胞輸出胸腺，移至外周免疫器官。脾臟是體內(nèi)最大的外周免疫器官（淋巴器官），是成熟的T、B細(xì)胞定居和發(fā)生免疫應(yīng)答的重要場所。因此，脾、胸腺兩個(gè)免疫器官的重量在一定程度上可以反映兩個(gè)免疫器官內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，從而間接了解體內(nèi)淋巴細(xì)胞總體水平[19]。因此，以胸腺指數(shù)和脾指數(shù)作為衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。表2顯示，黃芩可顯著提高弓形蟲感染小鼠脾、胸腺指數(shù)（P<0.01）。胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的升高初步表明黃芩可增強(qiáng)弓形蟲感染小鼠的免疫功能，以達(dá)到抗弓形蟲感染的目的。

3.4 黃芩可促進(jìn)弓形蟲感染小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖

表3顯示，黃芩可使ConA激發(fā)的小鼠脾細(xì)胞（主要是T淋巴細(xì)胞）增殖反應(yīng)明顯增強(qiáng)（P<0.01），表明黃芩在抗弓形蟲感染過程中可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，提高弓形蟲感染小鼠的細(xì)胞免疫功能。同時(shí)，黃芩可以提高弓形蟲感染小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，可能也與黃芩促進(jìn)免疫器官內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)。

綜上所述，黃芩可以顯著提高弓形蟲感染小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、外周血清IL-2含量及促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖。由此初步認(rèn)為，黃芩可以通過增強(qiáng)弓形蟲感染小鼠的細(xì)胞免疫功能而達(dá)到抗弓形蟲感染的作用。另外，黃芩對弓形蟲感染小鼠免疫細(xì)胞的具體調(diào)節(jié)機(jī)制及對其他細(xì)胞因子的分泌是否也有促進(jìn)作用，可在后續(xù)做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，以明確黃芩抗弓形蟲感染的詳細(xì)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，并為黃芩抗弓形蟲的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。