GFP報(bào)告因子結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的蛋白-蛋白相互作用單細(xì)菌水平分析

蘇柳欽,張健強(qiáng),何盛斌,吳麗娜,顏曉梅

(廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門361005)

蛋白-蛋白相互作用是細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分,參與了各種代謝途徑和生理過(guò)程[1-2]．對(duì)蛋白-蛋白相互作用進(jìn)行分析有助于解析疾病的發(fā)生機(jī)制,對(duì)藥物的設(shè)計(jì)篩選具有重要的指導(dǎo)意義[3]．基于腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)功能重構(gòu)的細(xì)菌雙雜交(bacterial adenylate cyclase two-hybrid,BACTH)系統(tǒng)是蛋白-蛋白相互作用經(jīng)典技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)的衍生,具有實(shí)驗(yàn)周期短、轉(zhuǎn)化率高、蛋白無(wú)需核定位等優(yōu)點(diǎn)[4]．BACTH系統(tǒng)利用了百日咳博代桿菌(Bordetellapertussis)中的AC催化域是由兩個(gè)互補(bǔ)片段T25和T18組成的特點(diǎn),當(dāng)T25和T18分別與可發(fā)生相互作用的多肽或者蛋白質(zhì)融合表達(dá)時(shí),嵌合蛋白的二聚化可以導(dǎo)致AC片段功能性的互補(bǔ)以及環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的生成，cAMP與分解代謝激活蛋白(catabolite activator protein,CAP)結(jié)合,從而調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá)[5]．目前,BACTH系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于特定蛋白對(duì)的相互作用鑒定以及蛋白質(zhì)相互作用文庫(kù)的篩選[6-7]．在生命醫(yī)學(xué)研究方面,BACTH系統(tǒng)也發(fā)揮了重要的作用．Zoued等[8]通過(guò)對(duì)細(xì)菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的收縮鞘中各組件的相互作用分析,揭示了其聚合的操縱機(jī)制以及內(nèi)管裝配的協(xié)調(diào)機(jī)制．Tao等[9]利用BACTH系統(tǒng)對(duì)肉毒毒素B進(jìn)行飽和誘變篩選,增強(qiáng)了工程型肉毒毒素B特異性地靶向人類突觸結(jié)合蛋白Ⅱ,提高了肉毒毒素B對(duì)神經(jīng)性疾病的治療效果．

BACTH系統(tǒng)主要以lacZ為報(bào)告基因,對(duì)于報(bào)告基因所表達(dá)的β-半乳糖苷酶,傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要是通過(guò)測(cè)定鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷或4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷這類特異性底物水解產(chǎn)生的分子吸光度或熒光的變化對(duì)酶活性進(jìn)行檢測(cè)[4,10]．然而，這類方法得到的是大量細(xì)菌中β-半乳糖苷酶表達(dá)量及活性的平均結(jié)果,掩蓋了細(xì)菌個(gè)體間β-半乳糖苷酶表達(dá)量的差異．在單細(xì)菌水平考察β-半乳糖苷酶的表達(dá)有利于更好地解析基因表達(dá)的隨機(jī)性、基因調(diào)控以及微生物的生理過(guò)程,對(duì)深入理解BACTH系統(tǒng)的工作機(jī)理從而針對(duì)性地改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法也有極大幫助．此外,單細(xì)菌水平的蛋白-蛋白相互作用研究有助于更準(zhǔn)確地考察蛋白在細(xì)菌介導(dǎo)的活細(xì)胞中相互作用的狀況,對(duì)于揭示蛋白-蛋白相互作用相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制具有明顯優(yōu)勢(shì)[11]．流式細(xì)胞術(shù)是一種功能強(qiáng)大的單細(xì)胞分析手段,具有檢測(cè)速度快、精度高和多參數(shù)分析等特點(diǎn),已在蛋白質(zhì)組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)中發(fā)揮重要的作用[12]．然而,由于細(xì)菌個(gè)體微小,傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀難以在單細(xì)菌水平對(duì)其內(nèi)部的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析并考察蛋白-蛋白相互作用．結(jié)合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測(cè)技術(shù),本課題組自行研制的超高靈敏流式檢測(cè)裝置(HSFCM)散射光通道可實(shí)現(xiàn)粒徑為24 nm的二氧化硅納米顆粒和粒徑為7 nm的金納米顆粒的檢測(cè),熒光通道的檢測(cè)靈敏度為3個(gè)Alexa Fluor 532分子[13],較傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的散射和熒光檢測(cè)靈敏度分別提升4～5個(gè)數(shù)量級(jí)和1～2個(gè)數(shù)量級(jí),已被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于細(xì)菌生化體系的分析[14-18]．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

菌株:大腸桿菌(Escherichiacoli) ER2738，在質(zhì)粒構(gòu)建中使用；大腸桿菌BTH101(基因型:F-,cya-99,araD139,galE15,galK16,rpsL1,hsdR2,mcrA1,mcrB1),由法國(guó)地中海微生物研究中心Emmanuelle Bouveret博士惠贈(zèng),為BACTH系統(tǒng)的報(bào)告菌株．

質(zhì)粒：pEB354(pKT25-linker)、pEB355(pUT18C-linker)、pEB356(pUT18C-pal)由Emmanuelle Bouveret博士惠贈(zèng)；pTW2(含lac啟動(dòng)子調(diào)控的gfp基因)由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所楊克遷博士惠贈(zèng)；質(zhì)粒pKT25-His-tolB、pKT25-lac-T18、pKT25-His-tolB-lac-T18-pal為本課題組構(gòu)建．

1.1.2 試 劑

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，TransStart FastPfu DNA Polyme-rase(AP221-01)、5×TransStart FastPfu Buffer、dNTP mixture購(gòu)自北京全式金公司，Seamless Assembly and Cloning Kit購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-gal)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，本研究所涉及的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表1所示．

表1 本研究所用引物

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(Airtech公司)，DYCP-31F瓊脂糖水平電泳儀(北京六一儀器廠)，SKY 200B小型全溫恒溫培養(yǎng)搖床(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司)，DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，Allegra X-15R Centrifuge低溫冷凍離心機(jī)(Beckman公司)，T100TMThermal Cycler基因擴(kuò)增儀(BIO-RAD 公司)，IX73 型倒置熒光顯微鏡(Olympus 公司)，本課題組自行研制的HSFCM．

1.2 方 法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

最早知道愛(ài)克發(fā)還是在兒時(shí)，記憶中Agfa膠卷是攝影發(fā)燒友的最愛(ài)，而這段回憶也拉近了我們與這位影像巨頭的距離。從初創(chuàng)歲月到今天的數(shù)碼時(shí)代，愛(ài)克發(fā)對(duì)影像的關(guān)注從未停步，150多年的深耕細(xì)作不僅構(gòu)成了其現(xiàn)有的三大產(chǎn)業(yè)版圖：由印版、CTP、噴墨設(shè)備、軟件等產(chǎn)品組成的印藝板塊，以及醫(yī)療板塊、特殊材料板塊，其中，印藝板塊占據(jù)其產(chǎn)業(yè)版圖的半壁江山，更使其以細(xì)分領(lǐng)域領(lǐng)導(dǎo)者的身份與實(shí)力，引導(dǎo)影像領(lǐng)域的技術(shù)變革和產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新。

質(zhì)粒pKT25-lac-T18的構(gòu)建:以質(zhì)粒pEB355為模板,用表1中引物lac-T18-F/lac-T18-R擴(kuò)增基因片段lac-T18,同時(shí),用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ對(duì)質(zhì)粒pEB354進(jìn)行單酶切,擴(kuò)增出的基因片段和酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析后,用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0試劑盒進(jìn)行純化,最后兩個(gè)片段采用Gibson組裝連接[21]．

(a)流體動(dòng)力學(xué)聚焦樣品流與激光光斑正交于流動(dòng)室的示意圖;(b)光路圖．圖1 實(shí)驗(yàn)室自行研制的雙通道HSFCM示意圖Fig.1 Schematic diagram of the laboratory-built dual-channel high sensitivity flow cytometer (HSFCM)

質(zhì)粒pKT25-His-tolB-lac-T18-pal的構(gòu)建:以質(zhì)粒pEB356為模板,用表1中引物lac-T18-pal-F/lac-T18-pal-R擴(kuò)增基因片段lac-T18-pal,同時(shí),用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ對(duì)質(zhì)粒pKT25-His-tolB進(jìn)行單酶切,擴(kuò)增出的基因片段和酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析后,用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purifi-cation Kit Ver.4.0試劑盒進(jìn)行純化,最后兩個(gè)片段采用Gibson組裝連接[21]．

1.2.2 細(xì)菌樣品的制備

提取質(zhì)粒pKT25-lac-T18、pKT25-His-tolB-lac-T18-pal,以BTH101作為報(bào)告菌株,按pKT25-lac-T18/pTW2、pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2的組合進(jìn)行共轉(zhuǎn)化．共轉(zhuǎn)化時(shí)兩種質(zhì)粒依次加入,細(xì)菌復(fù)蘇后涂布于含氨芐青霉素和卡那霉素的LB/IPTG/X-gal固體培養(yǎng)基上,于30 ℃培養(yǎng)48 h．隨后從平板上隨機(jī)挑取單菌落,接種于LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)22 h．移取50 μL菌液離心,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次后棄上清,于4 ℃下保存,待測(cè)．

1.2.3 單細(xì)菌水平gfp報(bào)告基因的表達(dá)分析

HSFCM檢測(cè):將待測(cè)樣品用PBS調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至109mL-1后上機(jī)檢測(cè),同時(shí)收集散射光信號(hào)和綠色熒光信號(hào)(BP520/35)．所用的HSFCM分為4個(gè)部分,分別為激光光源和光束形成系統(tǒng)、流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、光路系統(tǒng)(包括各種濾光片)以及信號(hào)檢測(cè)、存儲(chǔ)、顯示和分析系統(tǒng)[22-24]．如圖1所示,它的工作原理為:分散在溶液中的細(xì)菌與溶液一起由氮?dú)怛?qū)動(dòng)進(jìn)入毛細(xì)管,從毛細(xì)管流出后,溶液在鞘液作用下被聚焦形成直徑很小的液流,保證樣品以單個(gè)細(xì)菌通過(guò)激光探測(cè)區(qū)；激光器發(fā)出的488 nm激光經(jīng)反射鏡(M)反射后,被消色差膠合透鏡(L)聚焦為直徑約10 μm的激光光斑,激光光斑與被鞘液流聚焦后的樣品流正交于石英流動(dòng)室(C)的中心處；樣品由激光照射后發(fā)出的光信號(hào)經(jīng)非球面透鏡(AL)收集,被二向色濾光片(DicF-500)分成兩束,波長(zhǎng)小于500 nm的光信號(hào)(散射光)被90°反射入第1個(gè)光電倍增管(PMT-1)中檢測(cè),大于500 nm的光信號(hào)經(jīng)過(guò)邊緣濾光片(EF488)后,經(jīng)過(guò)帶通濾光片(BP520/35)濾除雜散光進(jìn)入第2個(gè)光電倍增管(PMT-2)檢測(cè)．

熒光顯微鏡成像:將待測(cè)樣品用PBS調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至1010mL-1,吸取10 μL樣品于載玻片上,洗耳球吹干后,滴加適量抗熒光猝滅劑,小心蓋上蓋玻片,并用指甲油將蓋玻片固定；然后,在100×放大的油鏡上滴加少量Nikon專用鏡油,放上制備好的玻片觀察．

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)相互作用的HSFCM檢測(cè)原理

圖2 基于GFP報(bào)告因子研究蛋白-蛋白相互作用的HSFCM檢測(cè)原理Fig.2 Schematic of HSFCM detection based on GFP reporter protein for protein-protein interaction study

如圖2所示,在BACTH-GFP系統(tǒng)中,質(zhì)粒pKT25-X-lac-T18-Y能同時(shí)獨(dú)立表達(dá)融合蛋白T25-X和T18-Y．質(zhì)粒pTW2中含有一段從BTH101基因組中截取的lac啟動(dòng)子序列,用以啟動(dòng)下游gfp基因的表達(dá)[25]．將以上兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到報(bào)告菌株BTH101中,X和Y蛋白表達(dá)并相互作用會(huì)誘發(fā)T25和T18功能性互補(bǔ)，繼而催化ATP生成cAMP,cAMP與CAP結(jié)合,激活gfp報(bào)告基因的表達(dá),所發(fā)出的綠色熒光可以通過(guò)HSFCM檢測(cè)．HSFCM每分鐘可以對(duì)高至1萬(wàn)個(gè)顆粒的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè),應(yīng)用HSFCM對(duì)單個(gè)細(xì)菌的散射光和熒光信號(hào)的同時(shí)檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用的單細(xì)菌水平的快速高通量分析．

2.2 單細(xì)菌水平蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)方法的建立

Tol-Pal系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌高度保守的膜蛋白系統(tǒng)之一,主要由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TolB、TolA、TolR、TolQ和脂蛋白Pal之間相互作用組成．其中TolB蛋白和Pal蛋白組成了細(xì)菌外膜復(fù)合體,它們之間的相互作用對(duì)于維持革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要[26]．本研究以Pal和TolB為模型,將它們克隆到雙雜交質(zhì)粒載體上,使它們分別與T18和T25片段融合表達(dá),并以不含相互作用蛋白的質(zhì)粒pKT25-lac-T18為陰性對(duì)照．如圖3所示,細(xì)菌BTH101 pKT25-lac-T18/pTW2經(jīng)過(guò)22 h培養(yǎng)后在綠色熒光檢測(cè)通道只有微弱的背景熒光信號(hào)(圖3(b)),表明不含相互作用蛋白的細(xì)菌無(wú)法激活gfp報(bào)告基因表達(dá)．而B(niǎo)TH101 pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2在綠色熒光通道有強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖3(d)),但是其熒光信號(hào)與散射光信號(hào)并非一一對(duì)應(yīng),部分細(xì)菌只有散射光信號(hào)．根據(jù)兩者的散射光信號(hào)與熒光信號(hào)峰面積的二維散點(diǎn)圖(圖3(e))以及熒光信號(hào)峰面積統(tǒng)計(jì)分布直方圖(圖3(f)),可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組樣品在熒光通道分成了兩群:66.1%的細(xì)菌的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于陰性對(duì)照組,可見(jiàn)蛋白相互作用激活了gfp報(bào)告基因表達(dá);另外33.9%的細(xì)菌的熒光信號(hào)分布與陰性對(duì)照組樣品重疊,表明這部分細(xì)菌的gfp報(bào)告基因未被激活．造成這一現(xiàn)象的可能原因是:在BACTH系統(tǒng)中相互作用蛋白和報(bào)告基因的表達(dá)都受乳糖操縱子的調(diào)控,蛋白發(fā)生相互作用后生成cAMP,cAMP激活報(bào)告基因表達(dá),生成的cAMP同樣也能激活相互作用蛋白的表達(dá)[4]．因此,相互作用蛋白的表達(dá)、cAMP的生成、報(bào)告基因的表達(dá)形成了復(fù)雜的正反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，造成了BACTH系統(tǒng)報(bào)告基因的異質(zhì)性表達(dá),部分細(xì)菌被完全激活而高表達(dá)蛋白,另外部分細(xì)菌未被激活而只有本底表達(dá)[19]．這種蛋白表達(dá)的差異容易被集權(quán)平均的檢測(cè)方法所掩蓋,因此,需要從單細(xì)菌水平分析才能揭示BACTH系統(tǒng)中蛋白表達(dá)存在的這種雙穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象,更準(zhǔn)確地分析蛋白質(zhì)之間的相互作用．

采用熒光顯微鏡進(jìn)一步對(duì)gfp報(bào)告的蛋白相互作用進(jìn)行表征．如圖3(g)～(j)所示,在熒光場(chǎng)視野下只有BTH101 pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2可以觀察到菌體發(fā)出明亮的熒光，對(duì)比明場(chǎng)下的細(xì)菌,可發(fā)現(xiàn)仍有部分細(xì)菌沒(méi)有熒光,顯微鏡觀察到的現(xiàn)象與HSFCM的檢測(cè)結(jié)果一致．

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)gfp報(bào)告基因表達(dá)的影響

為考察不同培養(yǎng)時(shí)間下BACTH-GFP系統(tǒng)報(bào)告因子表達(dá)量的變化，隨機(jī)挑取共轉(zhuǎn)化后在相應(yīng)抗性篩選平板上形成的單菌落，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后,每隔2 h取樣分析．如圖4所示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,表達(dá)GFP報(bào)告因子的細(xì)菌比例逐漸增加(從16 h的20.3%升高至24 h的58.4%),這部分細(xì)菌的熒光信號(hào)中位值也隨之增加(從16 h的17 224.5增加到24 h的29 740.6),說(shuō)明單個(gè)細(xì)菌GFP報(bào)告因子表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加不斷提高．當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到22 h之后,表達(dá)GFP報(bào)告因子的細(xì)菌比例以及單個(gè)細(xì)菌GFP報(bào)告因子表達(dá)量逐漸趨于穩(wěn)定,因此選擇培養(yǎng)22 h的細(xì)菌進(jìn)行HSFCM 檢測(cè)．

2.4 IPTG對(duì)gfp報(bào)告基因表達(dá)的影響

在BACTH系統(tǒng)中報(bào)告基因的表達(dá)受乳糖操縱子的調(diào)控,而乳糖操縱子存在正負(fù)調(diào)控機(jī)制．cAMP-CAP是一個(gè)重要的正調(diào)控物質(zhì),它與操縱子上的啟動(dòng)區(qū)結(jié)合,激活下游基因轉(zhuǎn)錄．另外,乳糖操縱子也受lacI基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控,阻遏蛋白通過(guò)與操縱子結(jié)合,阻止RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄下游基因．當(dāng)向體系中加入誘導(dǎo)劑時(shí),誘導(dǎo)劑會(huì)優(yōu)先與阻遏蛋白結(jié)合,使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,不再與操縱子上的DNA序列相結(jié)合,從而使RNA聚合酶能夠起始轉(zhuǎn)錄下游基因[27]．IPTG是一種作用極強(qiáng)的乳糖操縱子誘導(dǎo)劑,不被細(xì)菌代謝且性質(zhì)穩(wěn)定,被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的表達(dá)．因此,考察了不同濃度IPTG誘導(dǎo)下的gfp報(bào)告基因的表達(dá)情況．分別用0,50,200,500 μmol/L的IPTG對(duì)BTH101 pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),測(cè)定培養(yǎng)16,18,20,22,24 h后細(xì)菌表達(dá)GFP報(bào)告因子的情況．如圖5所示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,表達(dá)GFP報(bào)告因子的陽(yáng)性菌的熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加,然而在同一培養(yǎng)時(shí)間下,不同濃度IPTG對(duì)gfp報(bào)告基因的表達(dá)幾乎沒(méi)有影響．這可能是由于BTH101基因組中l(wèi)acI基因表達(dá)的阻遏蛋白量較少,引入的多拷貝質(zhì)粒中的lac啟動(dòng)子削弱了阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控作用,導(dǎo)致IPTG無(wú)法發(fā)揮誘導(dǎo)作用[28]．

圖5 在不同培養(yǎng)時(shí)間及不同濃度IPTG作用下表達(dá)GFP報(bào)告因子陽(yáng)性菌的熒光信號(hào)強(qiáng)度中位值Fig.5 The median fluorescence intensities of positive cells with expression of GFP reporter protein induced with various concentrations of IPTG for different cultivation time

2.5 不同單菌落gfp報(bào)告基因表達(dá)的異質(zhì)性分析

隨機(jī)挑取了10個(gè)共轉(zhuǎn)化后在相應(yīng)抗性篩選平板上形成的單菌落,擴(kuò)大培養(yǎng)22 h后采用HSFCM對(duì)細(xì)菌gfp報(bào)告基因表達(dá)情況進(jìn)行分析．如圖6所示,不同單菌落培養(yǎng)得到的菌液中表達(dá)GFP報(bào)告因子的陽(yáng)性菌之間表現(xiàn)出較大的熒光信號(hào)強(qiáng)度差異(圖6(a)),且表達(dá)GFP報(bào)告因子的細(xì)菌比例也呈現(xiàn)明顯的差異(圖6(b)),它們的平均值分別為16 022.9±3 742.8和(37.5±21.9)%,各自的變異系數(shù)為23.4%和58.1%．

這種異質(zhì)性現(xiàn)象是由于細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒拷貝數(shù)不同導(dǎo)致蛋白表達(dá)量存在較大的差異,這些差異隨著細(xì)菌的增殖被逐漸放大,最終導(dǎo)致單菌落之間蛋白表達(dá)的異質(zhì)性[4]．此外,在BACTH系統(tǒng)中,雙穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象也會(huì)造成單菌落之間蛋白表達(dá)的巨大差異．傳統(tǒng)表征方法獲得的是眾多細(xì)菌蛋白表達(dá)集權(quán)平均的結(jié)果,掩蓋了個(gè)體蛋白表達(dá)的異質(zhì)性,基于GFP報(bào)告因子結(jié)合超高靈敏流式檢測(cè)技術(shù)建立的研究方法從單細(xì)菌水平分析,真實(shí)地反映了報(bào)告基因的表達(dá)水平以及表達(dá)GFP報(bào)告因子的細(xì)菌所占比例,為蛋白質(zhì)相互作用研究提供了更加直觀準(zhǔn)確的分析方法．

3 結(jié) 論

本研究中引入lac啟動(dòng)子控制的gfp作為蛋白質(zhì)相互作用的報(bào)告基因,采用實(shí)驗(yàn)室自行研制的HSFCM建立了一種單細(xì)菌水平、高通量、快速的蛋白-蛋白相互作用分析方法．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:蛋白-蛋白相互作用激活了gfp報(bào)告基因的表達(dá),并存在雙穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象．單細(xì)菌水平的HSFCM分析真實(shí)地反映了蛋白質(zhì)相互作用報(bào)告基因的表達(dá)水平以及表達(dá)GFP報(bào)告因子的細(xì)菌所占的比例,相對(duì)于傳統(tǒng)集權(quán)平均的表征方法更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單．基于該方法,本研究發(fā)現(xiàn)不同單菌落GFP報(bào)告因子表達(dá)量和表達(dá)蛋白的細(xì)菌比例都存在較大的異質(zhì)性．以上結(jié)果表明建立的單細(xì)菌水平BACTH-GFP分析方法能夠揭示蛋白質(zhì)相互作用報(bào)告基因表達(dá)的個(gè)體差異,有效地區(qū)分表達(dá)GFP報(bào)告因子的陽(yáng)性菌和報(bào)告基因未被激活表達(dá)的陰性菌,為相互作用蛋白對(duì)的檢測(cè)及篩選提供了有效的分析手段,將有助于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的解析．

(a) 表達(dá)GFP報(bào)告因子的陽(yáng)性菌熒光信號(hào)強(qiáng)度中位值;(b) 表達(dá)GFP報(bào)告因子的細(xì)菌比例．圖6 不同單菌落gfp報(bào)告基因表達(dá)的異質(zhì)性分析Fig.6 Heterogeneity analysis of the expression of gfp reporter gene among different colonies