利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚(yú)核受體PXR基因初探*

成凱，馮永永，周莉，李凱彬，聶湘平

(1. 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生態(tài)系//水生生物研究所，廣東 廣州510632；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州510380)

孕烷X受體(Pregnane X receptor, PXR)是核受體超家族(NRs)中NR1I的重要成員之一，在保護(hù)生物機(jī)體免于內(nèi)源性和外源性物質(zhì)損傷方面有重要作用[1]。PXR 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控眾多與解毒代謝相關(guān)的基因，例如人體內(nèi)藥物代謝的主要酶系之一細(xì)胞色素P450(CYP)就是PXR轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游重要靶基因之一，該酶也是包括魚(yú)類在內(nèi)許多動(dòng)物代謝外源污染物的主要代謝酶系。因此PXR核轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)激活或抑制阻遏[2]，可調(diào)節(jié)外源污染物的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)[3]，對(duì)外源污染物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化、代謝有著重要的作用[4]。目前研究魚(yú)類生物PXR轉(zhuǎn)錄因子在環(huán)境污染物暴露下的調(diào)控響應(yīng)變化已有報(bào)道[5-6]。但對(duì)PXR轉(zhuǎn)錄因子在污染物解毒代謝中的具體作用機(jī)制還缺少深入研究。如果能利用新一代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[7]對(duì)該目標(biāo)基因進(jìn)行編輯，獲得PXR純?nèi)毕菪蚉XR(-/-)，對(duì)比較研究PXR轉(zhuǎn)錄因子在污染物代謝過(guò)程中作用將會(huì)有重要幫助。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是第三代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”[8]，該系統(tǒng)中crRNA(CRISPR-derived RNA)與tracrRNA(trans-activating RNA)結(jié)合形成一個(gè)單鏈向?qū)NA(guide RNA，gRNA)，能特異性識(shí)別目標(biāo)基因序列，并引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶準(zhǔn)確識(shí)別特定靶位點(diǎn)進(jìn)行DNA雙鏈剪切[9]，利用細(xì)胞的非同源末端自我連接修復(fù)機(jī)制，斷裂處的基因片段在自我修復(fù)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)插入或缺失突變現(xiàn)象[10]，從而改變基因組原始結(jié)構(gòu)，達(dá)成基因編輯目的。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以模式生物斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，建立魚(yú)類體內(nèi)和污染物代謝密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子PXR基因靶向敲除系統(tǒng)，獲得完全缺失PXR基因的斑馬魚(yú)，為PXR基因的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)研究材料。

1 材料與方法

野生型斑馬魚(yú)品系Tuebingen(Tu)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所提供，Cas9 mRNA表達(dá)質(zhì)粒采用pXT7-Cas9[11]，YFP-nanos3質(zhì)粒由南京大學(xué)動(dòng)物模式研究所提供[11-12]。

1.1 gRNA靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)

在NCBI上查詢斑馬魚(yú)PXR基因的核酸序列Sequence ID:XM_005167420.4，查詢PXR基因內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)及其轉(zhuǎn)錄本信息。設(shè)計(jì)原則：根據(jù)PXR基因組外顯子結(jié)構(gòu)(圖1)，靶位點(diǎn)選取其第2個(gè)外顯子，靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)應(yīng)在起始密碼子ATG之后，為了保證基因剪切被破壞，原則上不可選取5-UTR和3-UTR。以PXR基因的第2個(gè)外顯子的序列為模板，通過(guò)網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/設(shè)計(jì)gRNA靶位點(diǎn)，從在線設(shè)計(jì)結(jié)果中挑選符合要求的靶位點(diǎn)序列，并比對(duì)高評(píng)分且特異性強(qiáng)的靶位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)(圖2)。再根據(jù)各組gRNA靶位點(diǎn)序列(表1)分別設(shè)計(jì)其對(duì)應(yīng)的特異性正向引物(表2)。

圖1 PXR基因組外顯子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 PXR genome exon structure diagram

圖2 gRNA靶位點(diǎn)示意圖Fig.2 gRNA target mapgRNA具體序列見(jiàn)表1The gRNA specific sequence is shown in Table 1

gRNATarget sequencegRNA15'-CCCCTGGACGATTCGGGACACGG-3'gRNA25'-ACCGTGTCCCGAATCGTCCAGGG-3'gRNA35'-TAGATTTGTCGCCGCATACTTGG-3'gRNA45'-GTATGCGGCGACAAATCTACTGG-3'gRNA55'-AATGGAGGAGCTTTCTCCCCTGG-3'gRNA6 5'-GGGACACGGTGATGGGTCTGAGG-3'gRNA75'-CCGCATACTTGGCAAATTTTAGG-3'gRNA8 5'-CAGGATGAGTAAAGAAATGGAGG-3'

1)：Cas9 mRNA只能切割PAM(protospacer adjacent motif)上游的序列，紅色字體標(biāo)記為PAM區(qū)Cas9 mRNA can only shear the sequence of PAM upstream, the red font marks are the PAM area

表2 gRNA特異性正向引物Table 2 gRNA specific forward primer

1.2 體外轉(zhuǎn)錄合成gRNA

1.2.1 gRNA模板構(gòu)建 gRNA特異性的正向引物根據(jù)各組gRNA靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)，包括T7啟動(dòng)子序列，靶點(diǎn)序列及部分scaffold序列，通過(guò)此引物將T7啟動(dòng)子序列和靶點(diǎn)序列帶入。通用反向引物為部分scaffold序列及終止信號(hào)：5′-AAAAAAAGCACCGACTCGGT-3′。通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出目的片段，PCR反應(yīng)體系構(gòu)成：PrimeSTAR Max Premix 25 μL，gRNA特異性的正向引物和通用反向引物各2 μL，gRNA模板(即設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn))1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。

PCR反應(yīng)條件： 98 ℃下變性10 s，55 ℃下退火5 s, 72 ℃下延伸5 s, 共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；將PCR產(chǎn)物用w=2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，目標(biāo)大小為120 bp左右。

用RNase free的PCR產(chǎn)物回收試劑盒(Axgen)對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收完畢用DEPC-H2O溶解回收到的PCR產(chǎn)物。

1.2.2 gRNA體外轉(zhuǎn)錄 使用試劑盒MAXIscript?T7 Kit(Ambion)進(jìn)行g(shù)RNA體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄完成后，取1 μL產(chǎn)物用w=2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可檢測(cè)轉(zhuǎn)錄出的gRNA條帶的完整性，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量轉(zhuǎn)錄出gRNA濃度，存于-70 ℃。

1.3 Cas9和YFP-nanos3mRNA合成

以pXT7-Cas9質(zhì)粒為模板制備Cas9 mRNA，用EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切將質(zhì)粒線性化(EcoRⅠ和HindⅢ是pXT7-Cas9質(zhì)粒T7轉(zhuǎn)錄下游的2個(gè)酶切位點(diǎn)，雙酶切是為防止酶切后自連)；然后用m MessagemMachine SP6 Kit(Ambion，美國(guó))按說(shuō)明書(shū)的指示進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，完成轉(zhuǎn)錄后取1 μL產(chǎn)物用w=2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄的目的條帶完整性。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用試劑盒RNease Mini kit(Qiagen)純化。最后用紫外分光光度計(jì)測(cè)量轉(zhuǎn)錄出Cas9 mRNA濃度，存于-70 ℃。在注射gRNA與Cas9 mRNA時(shí)不能確保會(huì)在每一顆魚(yú)卵中得到表達(dá)，后續(xù)需要展開(kāi)大量的測(cè)序工作，為提高篩選效率在顯微注射中引入YFP-nanos3 mRNA，此mRNA會(huì)在斑馬魚(yú)胚胎中翻譯表達(dá)出黃色熒光蛋白，相關(guān)文獻(xiàn)證明，YFP基因以球蟲(chóng)基因?yàn)檩d體搭建后在真核細(xì)胞中黃色熒光蛋白能夠得以表達(dá)[13]，故利用其蛋白的熒光表達(dá)性狀進(jìn)行初步篩選可提高后續(xù)實(shí)驗(yàn)篩選效率。YFP-nanos3mRNA的制備方法與Cas9相同。

1.4 顯微注射

選取若干條野生型斑馬魚(yú)進(jìn)行雌雄配對(duì)，待其交配產(chǎn)卵后，收集挑選一細(xì)胞期的受精卵進(jìn)行注射，依照gRNA識(shí)別位點(diǎn)，將8個(gè)gRNA分為3組，第1組為gRNA1、gRNA4、gRNA6；第2組為gRNA3、gRNA5、gRNA7；第3組為gRNA2、gRNA8；使同一組內(nèi)gRNA識(shí)別位點(diǎn)無(wú)重復(fù)片段。將Cas9 mRNA調(diào)整到300 ng/μL，gRNA 300 ng/μL，YFP-nanos3 mRNA 300 ng/μL按1∶1∶1混勻注射，注射量為1～2 nL。

1.5 gRNA活性驗(yàn)證

1.5.1 提取斑馬魚(yú)基因組DNA 顯微注射24 h后，挑選有熒光表達(dá)的受精卵分別從注射組和對(duì)照組挑選活卵，用基因組DNA提取試劑盒(堯舜禹生物科技有限公司，南京)提取DNA，存于-20 ℃。

1.5.2 PXR基因的擴(kuò)增 以提取到的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

上游引物PXR6-F： 5′-ACAGATTTTGGTATCAGTG-3′

下游引物PXR5-R： 5′-TTATTAGTACGGGCTTGGA-3′

PCR反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性30 s，54 ℃下退火30 s, 72 ℃下延伸45 s, 共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；再在72 ℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物用w=2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，根據(jù)條帶可進(jìn)行初步分析。PCR的引物是根據(jù)NCBI上斑馬魚(yú)PXR的基因序列(Gene ID: 565875)進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.5.3 DNA序列分析 以上PCR產(chǎn)物用Gel Extraction Kit(OMEGA)試劑盒膠回收，用pMDTM18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)(TaKaRa)中，挑取單克隆，經(jīng)由廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果用Chromas和SnapGene軟件進(jìn)行分析比對(duì)，通過(guò)靶位點(diǎn)附近位置是否出現(xiàn)Indel突變以確定有活性的gRNA。

1.6 可遺傳突變個(gè)體的篩選與培育

檢測(cè)到突變的同批顯微注射受精卵孵化并飼養(yǎng)至性成熟，再與野生型雜交繁殖獲取F1代，對(duì)F1代剪尾鰭以提取DNA進(jìn)行測(cè)序鑒定，篩選出缺失PXR基因的雜合突變體，標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)至成魚(yú)，雜合突變體之間進(jìn)行雜交繁殖，得到F2代，仍然以剪尾鰭的方式提取DNA進(jìn)行基因鑒定，根據(jù)理論分析，在F2代便可以得到完全缺失PXR基因型的純合子斑馬魚(yú)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PXR(+4/+4)型斑馬魚(yú)在F2代中獲取，得以印證理論分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 gRNA活性測(cè)試

合成gRNA與Cas9mRNA后，用w=2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像結(jié)果顯示gRNA和Cas9 mRNA均為單一條帶(圖3)。

圖3 gRNA和Cas9 mRNA凝膠電泳檢測(cè)Fig.3 gRNA and Cas9 mRNA gel electrophoresis detectionA: gRNA凝膠電泳，其Marker是DL1000； B:Cas9mRNA凝膠電泳，其Marker是DL10000A: mRNA gel electrophoresis and its marker DL1000; B:Cas9 mRNA gel electrophoresis and its marker DL 10000

將合成后的gRNA、Cas9 mRNA和YFP-nanos3 mRNA通過(guò)顯微注射斑馬魚(yú)一細(xì)胞期受精卵的方式驗(yàn)證gRNA活性，選取有熒光的斑馬魚(yú)魚(yú)卵，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的序列，再進(jìn)行膠回收，與PMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆，通過(guò)菌液PCR獲得陽(yáng)性菌株，送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果顯示，gRNA1、gRNA6、gRNA7具有活性(表3，表4)，gRNA2、gRNA3、gRNA4、gRNA5和gRNA8均無(wú)活性，在此不再表述。

表3 預(yù)測(cè)區(qū)序列的敲除鑒定1Table 3 Deletion identification of the prediction area sequence 1

表4 預(yù)測(cè)區(qū)序列的敲除鑒定21)Table 4 Deletion identification of the prediction area sequence 2

1) 紅色字體標(biāo)注為插入基因片段，紅色標(biāo)注連字符為缺失基因片段

Red font is labeled as inserted gene fragment and red labeling hyphen is missing gene fragment

2.2 篩選穩(wěn)定敲除PXR基因的斑馬魚(yú)

將篩選到具有活性的gRNA1、gRNA6和gRNA7混勻后與Cas9 mRNA和YFP-nanos3 mRNA按照1∶1∶1的劑量顯微注射受精卵得到F0代，與野生型斑馬魚(yú)雜交繁殖獲取F1代，對(duì)F1代剪尾鰭以提取DNA進(jìn)行測(cè)序鑒定，篩選出缺失PXR基因的雜合突變體有4種突變型(圖4)，挑選indel 4 bp A型為F1代。標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)至成魚(yú)，F(xiàn)1代之間進(jìn)行雜交繁殖，得到F2代，在F2代中通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證挑選，indel 4 bp A峰圖(圖5)單一整齊，沒(méi)有雜峰套峰出現(xiàn)，表示兩條等位基因均在同一位點(diǎn)插入相同的4個(gè)堿基導(dǎo)致該段基因移碼突變，從而達(dá)到基因敲除的目的，得到純合突變體。

3 討 論

CRISPR是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對(duì)病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而進(jìn)化而來(lái)的獲得性免疫防御機(jī)制[14]。在此基礎(chǔ)上發(fā)展建立起來(lái)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近代分子生物學(xué)研究中一項(xiàng)重要革新技術(shù)，該技術(shù)可以直接對(duì)基因組進(jìn)行編輯，使目標(biāo)基因出現(xiàn)不可逆的改變[15]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與較早的鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)以及轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)系統(tǒng)相比，在設(shè)計(jì)上更為簡(jiǎn)便快捷，成本低廉且敲除高效[16]。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以模式生物斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，在PXR基因上選取其第二個(gè)外顯子，設(shè)計(jì)gRNA靶位點(diǎn)，體外轉(zhuǎn)錄合成gRNA和Cas9 mRNA，對(duì)野生型斑馬魚(yú)魚(yú)卵進(jìn)行顯微注射，進(jìn)行基因敲除。CRISPR/Cas9技術(shù)通過(guò)破壞DNA雙鏈引起細(xì)胞非同源末端自我修復(fù)，在自我修復(fù)過(guò)程中所發(fā)生的情況有缺失、插入和缺失插入同時(shí)存在，非同源末端自我修復(fù)導(dǎo)致的基因片段移碼突變類型是不可控因素，本實(shí)驗(yàn)在驗(yàn)證gRNA1、gRNA6、gRNA7具有活性后將三組混勻通過(guò)顯微注射進(jìn)入野生型斑馬魚(yú)魚(yú)卵，出現(xiàn)缺失和插入基因突變類型。其中缺失6 bp對(duì)PXR基因編碼的蛋白序列影響較小，插入4 bp B型包含插入3 bp和缺失1 bp，這種情況較為復(fù)雜，插入4 bp A型為完整插入4 bp，可以破壞原始基因序列并確保影響PXR基因編碼的蛋白序列，故而選取插入4 bp A型的斑馬魚(yú)通過(guò)逐代雜交篩選，最終獲得完全缺失PXR基因的斑馬魚(yú)，并能穩(wěn)定繁殖后代。

圖4 DNA序列測(cè)序圖Fig.4 Sequence map of DNA sequence紅色字體標(biāo)注為插入基因片段，紅色標(biāo)注連字符為缺失基因片段Red font is labeled as inserted gene fragment and red labeling hyphen is missing gene fragment

圖5 F2代DNA測(cè)序驗(yàn)證Fig.5 F2 generation DNA sequencing validation紅色下劃線與紅色字體標(biāo)注為插入的基因片段The red underline is marked with the red font as the inserted 4 bp

YFP-nanos3 mRNA表達(dá)的黃色熒光蛋白可發(fā)出穩(wěn)定熒光且不需要依賴其他輔助因子，轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞后的熒光蛋白基因穩(wěn)定且對(duì)多數(shù)宿主的生理無(wú)影響作用，是理想的報(bào)告基因，簡(jiǎn)化了顯微注射的檢測(cè)工作，通過(guò)直觀觀察篩選出研究對(duì)象[17]，提高實(shí)驗(yàn)效率。相關(guān)研究表明CRISPR/Cas9技術(shù)可成功建立在非模式生物當(dāng)中如羅非魚(yú)[18]，說(shuō)明CRISPR/Cas9技術(shù)具有普適性。本研究在斑馬魚(yú)體內(nèi)成功建立PXR基因的CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)，為后續(xù)PXR基因?qū)λ幬锎x的研究以及理解魚(yú)類PXR基因的功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。