枯草芽孢桿菌、蒙脫石及其互作對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能、 養(yǎng)分表觀利用率和腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體 基因表達的影響

陳繼發(fā) 朱 瑾 康克浪 曲湘勇* 薛宏宇 周學彬

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128；2.美國優(yōu)哉公司， 芝加哥IL60611；3.上海牧冠企業(yè)發(fā)展有限公司，上海201199)

動物機體的生長發(fā)育和維持生產(chǎn)不但與養(yǎng)分的攝入量有關(guān)，而且與其對養(yǎng)分的消化吸收能力緊密相關(guān)。眾所周知，腸道是動物對飼糧養(yǎng)分消化吸收的重要器官，擁有健康的腸道對動物而言至關(guān)重要。因此，改善動物腸道健康、提高飼料利用率是畜牧業(yè)健康發(fā)展面臨的重大課題?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis，BS)是生產(chǎn)中應用廣泛的微生物飼料添加劑之一，它可以優(yōu)化腸道菌群、改善腸道形態(tài)、增強機體免疫力、促進養(yǎng)分消化吸收，進而提高動物的生產(chǎn)性能[1-4]。蒙脫石(montmorillonite，MMT)是一種天然的硅鋁酸鹽礦物，有良好的離子交換性、吸附性和黏附性，能在動物腸道中吸附霉菌毒素、重金屬、細菌及其毒素，修復和保護消化道黏膜，已被證實可改善動物腸道健康[5-7]。但目前，關(guān)于MMT對飼糧養(yǎng)分利用影響的研究結(jié)論[8-9]不盡一致，還需進一步探討。飼糧中養(yǎng)分被動物攝入后需要在消化道進行一系列消化后降解為小分子物質(zhì)，再由腸道中相應的轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運進入細胞被機體吸收利用。因此，轉(zhuǎn)運載體的正常表達對于養(yǎng)分吸收至關(guān)重要，BS和MMT是否通過調(diào)節(jié)腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體的表達而影響飼糧養(yǎng)分的吸收，值得探討。另外，最近在斷奶仔豬上的研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌和MMT聯(lián)用對調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸黏膜屏障功能和提高生長性能的作用優(yōu)于這二者單獨使用[10]，這提示益生菌和MMT在維護腸道健康和促進養(yǎng)分消化吸收等方面可能具有協(xié)同作用，可使動物表現(xiàn)出更好的生產(chǎn)性能。因此，我們推測BS和MMT聯(lián)用可能更有利于提高飼糧養(yǎng)分利用率、改善產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能。目前，雖然關(guān)于BS和MMT單獨在產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)中的應用已有較多報道，但關(guān)于二者之間協(xié)同作用的研究尚未報道。鑒于此，本試驗旨在探討B(tài)S、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能、養(yǎng)分表觀利用率和腸道養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因表達的影響，并觀察BS和MMT是否具有協(xié)同作用，以期為其在產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BS為市售產(chǎn)品，活菌數(shù)≥1×109CFU/g。MMT為市售產(chǎn)品，其主要成分含量為：鈣型MMT>70%，無定形水合二氧化硅>15%，其他礦物元素<15%。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

本試驗于2017年7月21日至2017年10月7日在湖南生安賽特農(nóng)牧科技有限公司進行。采用2×2雙因子隨機試驗設計，主效應分別為BS(0、0.5 g/kg)、MMT(0、0.5 g/kg)及二者互作。選擇360只29周齡健康的羅曼粉殼蛋雞，隨機分為4組(每組6個重復，每個重復15只)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)、基礎(chǔ)飼糧+0.5 g/kg BS(BS組)、基礎(chǔ)飼糧+0.5 g/kg MMT(MMT組)、基礎(chǔ)飼糧+0.5 g/kg MMT+0.5 g/kg BS(MMT+BS組)。預試期7 d，正試期70 d。預試期各組產(chǎn)蛋雞統(tǒng)一飼喂基礎(chǔ)飼糧，每天對雞群進行觀察，并及時調(diào)整雞群，使各組產(chǎn)蛋雞的日采食量[(116.61±0.45) g，P=0.603]、產(chǎn)蛋率[(95.72±0.48)%，P=0.955]和蛋重[(59.90±0.21) g，P=0.689]差異不顯著。試驗用基礎(chǔ)飼糧參考《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)并結(jié)合生產(chǎn)實際配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼糧配制好后，準確稱取所需的BS和MMT添加到基礎(chǔ)飼糧中，逐級充分混勻，在配制MMT+BS組試驗飼糧時，先將所需的BS和MMT充分混勻后再逐級混勻于基礎(chǔ)飼糧中。

產(chǎn)蛋雞采用上、中、下3層階梯式籠養(yǎng)，每籠3只，每5籠1個重復，各組的試驗雞保證分布在上、中、下層的數(shù)量相等。每日喂料2次，撿蛋2次，上午、下午各勻料2次。各組產(chǎn)蛋雞飼養(yǎng)管理條件相同，試驗第1～5周雞舍溫度、相對濕度分別為(27.06±2.27) ℃、(77.39±6.13)%；試驗第6～10周雞舍溫度、相對濕度分別為(24.03±2.40) ℃、(77.07±6.21)%。產(chǎn)蛋雞自由采食、飲水，每日光照時間為16 h，自然光照和人工光照相結(jié)合。每日清掃雞舍1次，每周對雞舍噴霧消毒2次，每隔3 d清糞1次。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet：VA 7 500 IU，VD33 000 IU，VE 20 IU，VK32 mg，VB11.98 mg，VB24.98 mg，VB64.98 mg，VB120.02 mg，煙酸 nicotinic acid 30 mg，泛酸 pantothenate 15 mg，葉酸 folic acid 0.78 mg，生物素 biotin 0.2 mg，膽堿 choline 400 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 75 mg，Cu (as copper sulfate) 10 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg，Zn (as zinc sulfate) 70 mg，Mn (as manganese sulfate) 60 mg，I (as potassium iodide) 1 mg，Ca 3.3 g，P 1.05 g，NaCl 3.5 g。

2)營養(yǎng)水平均為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 生產(chǎn)性能

正式試驗期內(nèi)，每日記錄各組(以重復為單位)的產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、軟破殼蛋數(shù)和死淘雞數(shù)，每周統(tǒng)計1次采食量，計算統(tǒng)計期內(nèi)的平均日采食量(ADFI)、產(chǎn)蛋率、平均蛋重、料蛋比、日產(chǎn)蛋量和死淘率。

1.3.2 養(yǎng)分表觀利用率

代謝試驗進行3 d(試驗第66、67、68天)，采用內(nèi)源性指示劑法。每個重復隨機選取1只雞單獨飼養(yǎng)，在雞籠下面放干凈集糞盤。每天喂料和收糞2～3次，自由采食、飲水。收糞前仔細揀去糞盤中的羽毛、飼糧和皮屑等雜物，糞樣立即用10%鹽酸固定，將3 d收集的糞樣充分混勻并裝于密封袋，做好標記，-20 ℃冰箱保存。

將糞樣置于烘箱中，65 ℃烘干至恒重，然后于室溫下回潮，粉碎過40目篩，制得風干糞樣。將飼糧樣粉碎過40目篩。糞樣與飼糧樣做好標記，置于干燥器中密封保存。參照張麗英[11]的方法測定飼糧和糞便中干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、能量、粗脂肪、鈣和磷的含量。參照GB/T 23742—2009測定飼糧和糞便中鹽酸不溶灰分含量。養(yǎng)分表觀利用率計算公式如下：

某養(yǎng)分表觀利用率(%)=100-100×(糞便中 某養(yǎng)分含量×飼糧中鹽酸不溶灰分含量)/(糞便中 鹽酸不溶灰分含量×飼糧中某養(yǎng)分含量)。

1.3.3 腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體mRNA表達量

試驗結(jié)束后，從每個重復中隨機選取1只雞，屠宰后迅速剖開腹腔，取空腸并擠出食糜，用滅菌生理鹽水輕輕沖洗除去腸壁內(nèi)容物，用滅菌載玻片小心刮取空腸黏膜1～2 g，用錫箔紙包好，立即放入液氮速凍，運回實驗室后于-80 ℃冰箱凍存。

使用Trizol法提取空腸黏膜總RNA，并用蛋白核酸測定儀(ND-2000 UV，賽默飛世爾，美國)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物，大連)反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，并以其為模板使用熒光定量PCR試劑盒(寶生物，大連)參照其說明書進行熒光定量PCR擴增。熒光定量PCR儀為CFX96型(伯樂，美國)，反應體系為10 μL：SYBR 5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL，單蒸水(dH2O)3.2 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，39個循環(huán)；在65～95 ℃繪制熔解曲線。以β-肌動蛋白(β-actin)為參比基因，引物采用Primers軟件設計，由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表2，目的基因mRNA表達量采用2-ΔΔCt法計算。

表2 引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件中的一般線性模型(GLM)程序進行雙因素分析，并用Duncan氏法進行多重比較。結(jié)果以平均值和集合標準誤(SEM)表示，用P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有提高或降低的趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 BS、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表3可知，與對照組相比，各添加組產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率均顯著提高(P<0.05)；MMT組和MMT+BS組日產(chǎn)蛋量較對照組顯著提高(P<0.05)；MMT+BS組料蛋比較對照組和BS組顯著降低(P<0.05)；各組間ADFI、死淘率和平均蛋重均差異不顯著(P>0.05)。主效應分析表明，飼糧中添加BS顯著提高了產(chǎn)蛋率和日產(chǎn)蛋量(P<0.05)；飼糧中添加MMT顯著提高了產(chǎn)蛋率和日產(chǎn)蛋量(P<0.05)，顯著降低了料蛋比(P<0.05)，有提高平均蛋重的趨勢(P=0.090)；BS和MMT互作對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能無顯著影響(P>0.05)。

表3 BS、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 BS、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞養(yǎng)分表觀利用率的影響

由表4可知，BS組粗脂肪表觀利用率較MMT組有提高的趨勢(P=0.083)；與對照組相比，BS組和MMT+BS組能量表觀利用率顯著提高(P<0.05)；BS組和MMT+BS組粗蛋白質(zhì)表觀利用率均高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。主效應分析表明，飼糧中添加BS顯著提高了干物質(zhì)、粗脂肪、能量和粗蛋白質(zhì)的表觀利用率(P<0.05)；MMT、MMT和BS互作對產(chǎn)蛋雞養(yǎng)分表觀利用率均無顯著影響(P>0.05)。

2.3 BS、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體mRNA表達量的影響

由表5可知，MMT+BS組產(chǎn)蛋雞空腸黏膜易化葡萄糖轉(zhuǎn)運載體2(GLUT2)mRNA表達量較MMT組有提高的趨勢(P=0.072)；與對照組相比，各添加組產(chǎn)蛋雞空腸黏膜堿性氨基酸轉(zhuǎn)運載體1(CAT1)mRNA表達量均顯著提高(P<0.05)。主效應分析表明，飼糧中添加BS對產(chǎn)蛋雞腸黏膜各養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體mRNA表達量均無顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加MMT顯著上調(diào)了產(chǎn)蛋雞腸黏膜CAT1 mRNA表達量(P<0.05)；BS和MMT互作對產(chǎn)蛋雞腸黏膜GLUT2和CAT1 mRNA表達量有顯著影響(P<0.05)。

表4 BS、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞養(yǎng)分表觀利用率的影響

表5 BS、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞空腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體mRNA表達量的影響

3 討 論

3.1 BS、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加MMT能提高產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率和日產(chǎn)蛋量，降低料蛋比，該結(jié)果與前人的報道[12-14]基本一致。本試驗中，飼糧中添加MMT對飼糧中各養(yǎng)分的表觀利用率均無顯著影響，提示MMT可能不是通過促進養(yǎng)分的消化吸收而改善產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能的。本課題組前期的研究表明，MMT明顯增強了產(chǎn)蛋雞的抗氧化和免疫功能，降低了血清和腸道中內(nèi)毒素含量，改善了腸道菌群和腸黏膜形態(tài)[14-16]。因此，我們猜測MMT改善產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的原因可能與其維護腸道健康和提高機體的健康水平有關(guān)。目前，關(guān)于BS對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能影響的研究結(jié)論不盡一致，但總體上表明其能改善產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能。Guo等[2]和Zhang等[17]均報道，BS不影響產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率、平均蛋重和ADFI，但會降低料蛋比；而Ribeiro等[3]研究表明，飼糧中添加BS后產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率提高了2.63%，日產(chǎn)蛋量提高了3.96%，但料蛋比無顯著變化。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加BS顯著提高了產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率和日產(chǎn)蛋量，對平均蛋重、料蛋比和ADFI無顯著影響。本試驗還發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加BS提高了產(chǎn)蛋雞對飼糧中干物質(zhì)、粗脂肪、能量和粗蛋白質(zhì)的表觀利用率，說明BS可通過促進飼糧養(yǎng)分的消化吸收而改善產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能。以上試驗結(jié)果的差異可能是由于產(chǎn)蛋雞的飼養(yǎng)階段、環(huán)境衛(wèi)生條件、試驗周期以及BS的來源、添加水平等因素的不同所致。本試驗首次探討了BS和MMT在產(chǎn)蛋雞上的聯(lián)用效果，結(jié)果表明，MMT+BS組產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋量和平均蛋重均高于BS組和MMT組，且料蛋比顯著低于對照組和BS組，說明二者聯(lián)用可獲得更佳的生產(chǎn)性能。類似的，Cao等[10]報道，MMT-嗜酸乳桿菌復合物對仔豬促生長的效果明顯優(yōu)于單獨添加MMT或嗜酸乳桿菌。MMT和益生菌的互作機制可能如下：MMT通過物理吸附作用，部分固定益生菌于其表面，使益生菌覆蓋或埋藏于蒙脫石的顆粒中，可能為益生菌對抗消化道中的惡劣環(huán)境提供物理屏障[18]；MMT可在消化道內(nèi)延展，形成連續(xù)的保護膜，且能夠與消化道黏液蛋白靜電結(jié)合，促進黏液量的增加和黏液質(zhì)量的改善，修復和保護腸道黏膜[19]，可能利于外源益生菌短暫定植于腸道，發(fā)揮生態(tài)效應；此外，MMT可吸附腸道有害菌，優(yōu)化腸道菌群[6]，或許間接提高了益生菌同有害菌的競爭力，增強益生功效。益生菌和MMT聯(lián)用具有一定優(yōu)勢，值得進一步探討，其聯(lián)合作用機制還需深入地研究；另外，以MMT為載體固定BS，制備MMT-BS復合物，猜想其作用效果可能優(yōu)于二者簡單的物理混合，值得關(guān)注和探討。

3.2 BS、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞養(yǎng)分表觀利用率的影響

研究表明，BS可分泌植酸酶、纖維素酶和淀粉酶等多種酶類，補充動物內(nèi)源酶的不足[20-21]；BS能夠促進消化酶的分泌，提高腸道中消化酶和二糖酶的活性[4,22]；另外，BS還能改善動物腸道形態(tài)，如提高絨毛高度、降低隱窩深度、增加養(yǎng)分與腸絨毛的接觸面積[1,4]。綜上，BS可通過產(chǎn)生多種酶類、促進消化酶分泌和改善腸黏膜形態(tài)等促進養(yǎng)分的消化與吸收，提高飼糧養(yǎng)分的利用率。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加BS能夠提高產(chǎn)蛋雞對飼糧中干物質(zhì)、粗脂肪、能量和粗蛋白質(zhì)的表觀利用率，該結(jié)果與前人在蛋雞[4]、肉雞[23]和鵝[24]上的試驗結(jié)果基本一致。董淑慧[8]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5%或1.0%的MMT不影響奶牛飼糧中干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、纖維和有機物的消化率，而添加2.5%以上的MMT使得養(yǎng)分的消化率顯著降低；李靜等[9]報道，肉雞飼糧中添加0.1%的載銅MMT不影響干物質(zhì)、能量和粗蛋白質(zhì)的表觀利用率，而添加0.2%以上的載銅MMT后養(yǎng)分表觀利用率顯著降低。上述研究表明，添加較低水平的MMT不影響飼糧養(yǎng)分的利用率，本試驗的結(jié)果也證實了這一結(jié)論。MMT比表面積大，表面分布著無數(shù)微孔，具有很強的吸附性能，在腸道中可能會吸附飼糧養(yǎng)分，影響?zhàn)B分利用；同時，其能保護消化道黏膜，增加腸道食糜黏度，改善腸道健康，可能也利于養(yǎng)分消化、吸收。但是，過量添加MMT會稀釋飼糧養(yǎng)分，且其對養(yǎng)分的吸附作用也會加強，進而降低養(yǎng)分的利用率。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，與單獨添加MMT相比，MMT和BS聯(lián)用顯著提高了能量的表觀利用率，干物質(zhì)、粗脂肪和粗蛋白質(zhì)的表觀利用率也有所提高；然而，MMT和BS聯(lián)用與單獨添加BS相比并沒有表現(xiàn)出優(yōu)勢，二者聯(lián)用對促進飼糧養(yǎng)分利用是否具有協(xié)同作用還有待進一步探討。

3.3 BS、MMT及其互作對產(chǎn)蛋雞腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因表達的影響

糖類、蛋白質(zhì)和脂類是動物生長和維持生產(chǎn)不可或缺的三大養(yǎng)分，它們被動物攝入后需要在胃腸道中進行一系列消化后降解為氨基酸、小肽、單糖和脂肪酸等小分子物質(zhì)，再由腸道刷狀緣膜和基底膜中相應轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運進入血液循環(huán)供機體代謝使用。因此，轉(zhuǎn)運載體的正常表達對于動物機體至關(guān)重要。本試驗發(fā)現(xiàn)，BS、MMT及其聯(lián)用均能上調(diào)產(chǎn)蛋雞腸黏膜CAT1 mRNA表達量，二者聯(lián)用還有提高GLUT2 mRNA表達量的趨勢，且二者互作對CAT1和GLUT2 mRNA表達量有顯著影響，提示BS和MMT聯(lián)用可增強腸道對堿性氨基酸和葡萄糖的吸收能力，有利于提高飼糧養(yǎng)分的利用率。本試驗中，雖然MMT+BS組干物質(zhì)、能量和粗蛋白質(zhì)的表觀利用率均高于其他組，但BS和MMT對各養(yǎng)分的表觀利用率均未產(chǎn)生顯著的交互作用。動物體內(nèi)養(yǎng)分代謝的過程相對復雜，盡管BS和MMT聯(lián)用促進了腸道對飼糧養(yǎng)分的吸收，使更多的養(yǎng)分能夠進入血液循環(huán)供機體代謝使用，但代謝過程中可能受到其他因素的影響，導致養(yǎng)分的利用率并沒有明顯提高；此外，本研究僅是從轉(zhuǎn)錄水平初步探討了養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因的表達情況，基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達與在蛋白質(zhì)水平上的表達可能存在一定差異，本研究中養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因表達的結(jié)果還需在蛋白質(zhì)水平上進行驗證。腸上皮細胞中轉(zhuǎn)運載體的表達受小腸腸腔中養(yǎng)分的調(diào)節(jié)，其含量增加，相應轉(zhuǎn)運載體的數(shù)量和活性也隨之增加[25-26]。我們猜測MMT和BS可能是通過促進飼糧養(yǎng)分的消化，使腸腔中小分子養(yǎng)分含量增加而上調(diào)相關(guān)轉(zhuǎn)運載體基因的表達。目前，關(guān)于MMT和BS對動物腸道養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因表達影響的研究非常少，今后還需進一步探討。

4 結(jié) 論

① 飼糧中單獨添加BS和MMT及二者聯(lián)用均能夠提高產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率和日產(chǎn)蛋量。

② 飼糧中添加BS能夠提高產(chǎn)蛋雞對飼糧中干物質(zhì)、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)和能量的表觀利用率。

③ 飼糧中單獨添加BS和MMT及二者聯(lián)用均能夠上調(diào)產(chǎn)蛋雞腸黏膜CAT1的表達。