絨山羊羔羊和成年羊前體脂肪細(xì)胞的 原代培養(yǎng)及傳代方法

張清月 王 雪 劉樹(shù)林 于 洋 郭曉宇 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸代謝與羊肉風(fēng)味密切相關(guān)。脂肪細(xì)胞是由前體脂肪細(xì)胞分化而來(lái)的，且該過(guò)程涉及一系列決定脂肪細(xì)胞形成的轉(zhuǎn)錄因子，所以前體脂肪細(xì)胞是研究動(dòng)物脂肪代謝機(jī)理的理想模型。體外培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞，可重現(xiàn)脂肪細(xì)胞的發(fā)生、增殖和分化的全過(guò)程，也便于觀察各種因素對(duì)細(xì)胞的影響，可用于探討脂肪形成機(jī)理，研究對(duì)脂肪形成有效調(diào)控的方法。目前，國(guó)內(nèi)利用膠原酶法已建立起牛[1]、綿羊[2]、豬[3]和絨山羊[4]等多種動(dòng)物的前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)模型，但普遍來(lái)源于幼齡動(dòng)物。脂肪細(xì)胞的數(shù)量在生命早期就已基本確定[5]，隨著動(dòng)物年齡的增長(zhǎng)，前體脂肪細(xì)胞逐漸分化為脂肪細(xì)胞，所以利用膠原酶消化直接得到動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞只適用于胚胎和幼齡動(dòng)物，這使得利用前體脂肪細(xì)胞模型進(jìn)行脂肪代謝的機(jī)理研究受到了動(dòng)物年齡的限制，因此，研究成年動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法是非常必要的。目前，成年動(dòng)物的前體脂肪細(xì)胞主要是利用“天花板”法培養(yǎng)成熟脂肪細(xì)胞后再去分化獲得。成熟脂肪細(xì)胞的去分化是一個(gè)以脂解為主并伴有一定水平成脂的脂質(zhì)代謝過(guò)程[6]。在成熟脂肪細(xì)胞積聚的過(guò)程中，其脂肪酸代謝和脂滴代謝受基因調(diào)控最終致使脂滴消失[7]，并通過(guò)自分泌和旁分泌途徑刺激脂肪細(xì)胞分解，尤其是降低脂蛋白酯酶的生成及活性，阻止前體脂肪細(xì)胞分化，誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞逆分化，以促成脂肪細(xì)胞的去分化[8]。但目前對(duì)于“天花板”法的研究主要集中于人[8]、鼠[9]、豬[10]、牛[11]和兔[12]等動(dòng)物，而利用此法從成年絨山羊的脂肪組織中分離培養(yǎng)得到前體脂肪細(xì)胞的研究報(bào)道甚少。而且，傳統(tǒng)“天花板”法使用培養(yǎng)瓶，需要大量的培養(yǎng)基，且對(duì)起始細(xì)胞接種量要求較高，盡管有研究通過(guò)將培養(yǎng)皿和蓋玻片結(jié)合而對(duì)傳統(tǒng)方法做出了改進(jìn)，但圓形蓋玻片取材困難，且在切割過(guò)程中很難避免污染，仍在一定程度上使得研究工作受阻[13]。鑒于此，本論文旨在以阿爾巴斯白絨山羊的3月齡羔羊及成年羊腎周脂肪組織為試驗(yàn)材料，探索絨山羊羔羊和成年羊前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代方法，并對(duì)使用培養(yǎng)皿的“天花板”法做出改進(jìn)，為通過(guò)前體脂肪細(xì)胞深入開(kāi)展絨山羊脂肪代謝機(jī)理的研究提供基礎(chǔ)，對(duì)絨山羊脂肪代謝的調(diào)節(jié)和羊肉品質(zhì)的改善具有重要的理論與實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑儀器

試驗(yàn)動(dòng)物：3月齡阿爾巴斯白絨山羊羔羊和阿爾巴斯白絨山羊成年母羊。

主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗和胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(ITS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Ⅰ型膠原酶、地塞米松(配制1 mg/mL工作液)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，配制100 mg/mL工作液)、二甲基亞砜(DMSO)、兩性霉素B(配制2.5 mg/mL工作液)和油紅O均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，其他試劑均為分析純。

主要儀器：離心機(jī)、倒置顯微鏡、超凈工作臺(tái)、37 ℃ CO2培養(yǎng)箱、37 ℃恒溫水浴鍋、37 ℃恒溫?fù)u床、25 cm2Corning細(xì)胞培養(yǎng)瓶、35 mm Corning細(xì)胞培養(yǎng)皿。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羔羊前體脂肪細(xì)胞的原代與傳代培養(yǎng)

羔羊前體脂肪細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)：試驗(yàn)采用Ⅰ型膠原酶法分離獲得前體脂肪細(xì)胞。采集阿爾巴斯白絨山羊羔羊腎周脂肪組織，用75%酒精浸泡30 s后立刻放入含有雙抗的PBS中。超凈臺(tái)內(nèi)用含雙抗的PBS沖洗數(shù)次，剔除可見(jiàn)血管和結(jié)締組織，剪成0.5～1.0 mm的脂肪小塊，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌廣口玻璃瓶?jī)?nèi)，加入0.1%的Ⅰ型膠原酶(V脂肪小塊∶V膠原酶=1∶3)，在37 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化1 h，消化液經(jīng)200目細(xì)胞篩過(guò)濾，濾液于250×g離心10 min。棄去所得上清液，沉淀用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含DMEM/F12培養(yǎng)基15.6 g/L和碳酸氫鈉1.2 g/L)制成細(xì)胞懸液，于250×g離心10 min，棄去上清液，重復(fù)上步離心步驟后，將沉淀重懸于5 mL完全培養(yǎng)基(含25% FBS、2.5%雙抗和0.25%兩性霉素B工作液)，并接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，每2天換1次液。

羔羊前體脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：原代細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%匯合時(shí)(約第5天)，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，每培養(yǎng)瓶加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液。顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞回縮成圓點(diǎn)狀并有細(xì)胞飄起時(shí)，加入3 mL完全培養(yǎng)基終止消化。收集細(xì)胞懸液，250×g離心10 min，棄上清，PBS沖洗后，用5 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1∶3的比例進(jìn)行傳代(即F1代)接種培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每2天換液1次，直至細(xì)胞匯合并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶(約第7天)再傳第2代(即F2代)。

1.2.2 成年羊前體脂肪細(xì)胞的原代與傳代培養(yǎng)

成年羊前體脂肪細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)：試驗(yàn)采用Ⅰ型膠原酶消化法與改進(jìn)后的“天花板”法分離培養(yǎng)得到成熟脂肪細(xì)胞后，利用去分化的方法得到前體脂肪細(xì)胞。采集阿爾巴斯白絨山羊成年羊腎周脂肪組織，用75%酒精浸泡30 s后立刻放入含有雙抗的PBS中，用和羔羊脂肪組織相同的方法進(jìn)行PBS沖洗、剪碎、消化、過(guò)濾和離心。離心后，取上清(脂肪細(xì)胞懸浮于上清中)，與等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻，取1 mL接種于35 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿，注滿完全培養(yǎng)基至將要溢出時(shí)，改進(jìn)原有培養(yǎng)方法，將配套培養(yǎng)皿的皿蓋倒置滑動(dòng)地覆蓋在皿上，以避免氣泡產(chǎn)生，從而借助液體表面張力使皿蓋與皿牢牢吸住，確保密閉環(huán)境。將其翻轉(zhuǎn)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，成熟脂肪細(xì)胞由于受浮力作用將漂浮到“天花板”面生長(zhǎng)。隨后每2 d換1次液，成熟脂肪細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期，逐漸吐出胞內(nèi)脂滴，7 d后基本去分化為梭形，可貼壁生長(zhǎng)，將培養(yǎng)皿正立，正常培養(yǎng)，至脂滴完全消失且細(xì)胞去分化為具有成纖維細(xì)胞形態(tài)的前體脂肪細(xì)胞為止。

成年羊前體脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與前述的羔羊前體脂肪細(xì)胞傳代培養(yǎng)相同。

1.2.3 羔羊前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

參考司徒鎮(zhèn)強(qiáng)等[14]的方法，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)羔羊前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。取羔羊原代前體脂肪細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，傳代并接種至35 mm培養(yǎng)皿，隨機(jī)分為8組，每組3個(gè)重復(fù)，每2 d對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，至第14 d為止。按公式計(jì)算前體脂肪細(xì)胞的倍增時(shí)間:

DT=t×lg2/(lgNt-lgN0)。

式中：DT為細(xì)胞倍增時(shí)間；t為培養(yǎng)時(shí)間；N0為首次計(jì)數(shù)獲得的細(xì)胞數(shù)；Nt為培養(yǎng)t時(shí)間后的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 羔羊和成年羊前體脂肪細(xì)胞的鑒定

將F2代前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞后進(jìn)行油紅O染色，鑒定培養(yǎng)得到的細(xì)胞是否為前體脂肪細(xì)胞。

羔羊及成年羊前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：將F2代細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%匯合時(shí)，換用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10% FBS、0.04%地塞米松工作液、0.011% IBMX工作液、0.5% ITS、2%雙抗和0.2%兩性霉素B工作液)培養(yǎng)2 d，再換胰島素培養(yǎng)基(含10% FBS、0.5% ITS、4%雙抗和0.4%兩性霉素B工作液)培養(yǎng)2 d，最后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，直至80%的細(xì)胞出現(xiàn)脂滴。

羔羊及成年羊前體脂肪細(xì)胞的鑒定：采用油紅O染色法對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行分化鑒定。羔羊前體脂肪細(xì)胞及成年羊去分化得到的前體脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)成熟后，棄去完全培養(yǎng)基，用PBS漂洗2次。用4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗2次，油紅O(1%油紅O溶于異丙醇，蒸餾水稀釋1.67倍)染色1 h，棄染色液，用蒸餾水漂洗數(shù)次后，于倒置顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 原代培養(yǎng)的羔羊前體脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)2 d時(shí)，大部分為短梭形或不規(guī)則三角形，伸展?fàn)顟B(tài)較明顯(圖1-A)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，第3、4天貼壁細(xì)胞體積更大，更加伸展，纖維狀更加明顯(圖1-B、圖1-C)。之后細(xì)胞開(kāi)始迅速增殖，密度明顯增大，甚至出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞發(fā)生接觸抑制和密度抑制，大量匯合后生長(zhǎng)停止，其中有的細(xì)胞出現(xiàn)自分化，分化的細(xì)胞開(kāi)始沉積脂肪顆粒，胞內(nèi)出現(xiàn)很多小脂滴(圖1-D)。

A：原代培養(yǎng)第2天的細(xì)胞；B：原代培養(yǎng)第3天的細(xì)胞；C：原代培養(yǎng)第4天的細(xì)胞；D：原代培養(yǎng)第5天的細(xì)胞。

A： cells on day 2 of primary culture (×200); B： cells on day 3 of primary culture (×200); C： cells on day 4 of primary culture (×100); D： cells on day 5 of primary culture (×100).

圖1原代培養(yǎng)羔羊前體脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

Fig.1 Morphological observation of primary cultured preadipocytes of lambs

2.2 傳代培養(yǎng)的羔羊前體脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

F1代和F2代細(xì)胞與原代細(xì)胞形態(tài)特征很相似，呈纖維狀。稍有不同即F1代和F2代細(xì)胞成分更均一，形態(tài)更一致，生長(zhǎng)更旺盛，抗污染性更強(qiáng)，不易受雜菌污染，自分化現(xiàn)象減少(圖2-A、圖2-B)。

2.3 羔羊前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

如圖3所示，羔羊前體脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈“S”型，接種4 d內(nèi)細(xì)胞處于停滯期，生長(zhǎng)緩慢，4 d后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 d后脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，計(jì)算所得前體脂肪細(xì)胞的倍增時(shí)間為6.9 d。

2.4 羔羊前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)、分化及鑒定

將經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)的F2代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，可在鏡下觀察到其依次經(jīng)歷分化準(zhǔn)備期、分化啟動(dòng)期、快速分化期和分化成熟期，最后分化為脂肪細(xì)胞。

A: F1代培養(yǎng)第2天的細(xì)胞；B: F2代培養(yǎng)4 h的細(xì)胞。

A: cells of F1 on day 2 of culture (×100); B: cells of F2 at 4 h of culture (×100).

圖2傳代培養(yǎng)羔羊前體脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

Fig.2 Morphological observation of passaged cultured preadipocytes of lambs

圖3 羔羊前體脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of preadipocytes of lambs

分化準(zhǔn)備期：將匯合度達(dá)90%的F2代細(xì)胞再培養(yǎng)2 d(記為分化第2天)，以使細(xì)胞從生長(zhǎng)周期中退出，為下一步分化作好準(zhǔn)備(圖4-A)。

分化啟動(dòng)期：換用誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)2 d(記為分化第4天)，此時(shí)細(xì)胞在誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下，進(jìn)入分化啟動(dòng)期，纖維狀更加明顯(圖4-B)。

快速分化期：再換用胰島素分化培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d(記為分化第6天)，細(xì)胞迅速進(jìn)入分化狀態(tài)，胞質(zhì)內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)小脂滴，但數(shù)量較少。

分化成熟期：換用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d(記為分化第8天)，胞內(nèi)脂滴更加明顯，油紅O染色呈陽(yáng)性并能看到標(biāo)志性“指環(huán)”(圖4-C)。分化第10天胞內(nèi)脂滴變多且體積變大，脂滴融合，占據(jù)細(xì)胞大部分體積。有些脂滴分泌到培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液變粘稠。部分細(xì)胞脫落，浮于培養(yǎng)液內(nèi)。油紅O染色鑒定后，脂滴被染成紅色(圖4-D)，說(shuō)明這些細(xì)胞是脂肪細(xì)胞，分化之前的細(xì)胞為前體脂肪細(xì)胞。經(jīng)過(guò)觀察，從前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)為成熟的脂肪細(xì)胞約需10 d。

A: F2代分化第2天的細(xì)胞；B: F2代分化第4天的細(xì)胞；C: F2代分化第8天油紅O鑒定； D: F2代分化第10天油紅O鑒定。

A: cells of F2 on day 2 of differentiation (×200); B: cells of F2 on day 4 of differentiation (×200); C: cells of F2 on day 8 of differentiation, stained by oil red O (×200); D: cells of F2 on day 10 of differentiation, stained by oil red O (×100).

圖4羔羊前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)、分化及鑒定形態(tài)學(xué)觀察

Fig.4 Morphological observation of inducement, differentiation and identification of preadipocytes of lambs

2.5 羔羊前體脂肪細(xì)胞胰酶消化形態(tài)學(xué)觀察

不同組織或細(xì)胞對(duì)胰酶作用的反應(yīng)是不一樣的，且消化時(shí)間越久對(duì)細(xì)胞損傷越大。絨山羊羔羊前體脂肪細(xì)胞消化60 s時(shí)，鏡下觀察可見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞成圓點(diǎn)(圖5-A)，說(shuō)明細(xì)胞已被消化下來(lái)；消化90 s時(shí)細(xì)胞漂浮(圖5-B)，說(shuō)明消化時(shí)間略長(zhǎng)，可能已對(duì)細(xì)胞造成損傷。因此，我們篩選出的適宜消化時(shí)間為60 s。

A:前體脂肪細(xì)胞胰酶消化60 s；B:前體脂肪細(xì)胞胰酶消化90 s。

A: preadipocytes trypsinized for 60 s (×100); B: preadipocytes trypsinized for 90 s (×100).

圖5羔羊前體脂肪細(xì)胞胰酶消化形態(tài)學(xué)觀察

Fig.5 Morphological observation of trypsin digestion of preadipocytes of lambs

2.6 成年羊成熟脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)與去分化

利用膠原酶法從成年羊腎周脂肪組織上獲得的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)第2天時(shí)，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，成熟脂肪細(xì)胞漂浮到倒置培養(yǎng)皿的“天花板”層，貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞為單室脂滴成熟脂肪細(xì)胞形態(tài)，并觀察到正在分裂的脂肪細(xì)胞(圖6-A)；培養(yǎng)第5天時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始成梭型(圖6-B)；隨著天數(shù)的增加，梭型細(xì)胞逐漸增多，還可觀察到細(xì)胞正在“吐”出脂滴(圖6-C)，第14天時(shí)細(xì)胞中脂滴完全消失，去分化為具有成纖維細(xì)胞形態(tài)(圖6-D)的前體脂肪細(xì)胞。

2.7 成年羊前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與鑒定

隨著F2代前體脂肪細(xì)胞的分化，被油紅O染色的細(xì)胞逐漸增多(圖7-A)，在分化第12 天時(shí)，90%以上的細(xì)胞油紅O染色呈陽(yáng)性(圖7-B)，說(shuō)明分化后形成的細(xì)胞是脂肪細(xì)胞，故用本法培養(yǎng)出的細(xì)胞為前體脂肪細(xì)胞。

3 討 論

膠原酶消化法是一種分離細(xì)胞的基本方法。膠原酶是從細(xì)菌中提取出來(lái)的，對(duì)膠原和胞間質(zhì)有較好的消化作用且對(duì)細(xì)胞本身影響較小，可使細(xì)胞脫離膠原成分而不受傷害。前體脂肪細(xì)胞可來(lái)源于不同的脂肪組織，利用膠原酶消化法國(guó)內(nèi)外已建立了多種動(dòng)物的前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)模型，但均來(lái)源于幼齡動(dòng)物。如蔡勇等[2]從1日齡綿羊的腎周脂肪組織獲得前體脂肪細(xì)胞；且來(lái)源于1日齡絨山羊肌內(nèi)脂肪組織[4]、60日齡豬皮下脂肪組織[3]、1日齡豬皮下脂肪組織[15]、20日齡鼠腹股溝和附睪脂肪組織[16]、新生牛腹股溝和腎周脂肪組織[1]以及7日齡豬頸部和背部皮下脂肪組織[17]的前體脂肪細(xì)胞也已通過(guò)膠原酶法獲得，利用油紅O染色法可將脂滴染成紅色，且脂滴邊界出現(xiàn)透明“指環(huán)”結(jié)構(gòu)，該法可簡(jiǎn)便快捷地測(cè)定體外培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，Ramirez-Zacarias等[18]報(bào)道其敏感性和準(zhǔn)確性同前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的標(biāo)志酶甘油磷酸脫氫酶相似，常用于體外前體脂肪細(xì)胞的鑒定。因此，本研究采用該方法鑒定前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化情況，結(jié)果得出，以3月齡的羔羊腎周脂肪組織為材料獲得的前體脂肪細(xì)胞形態(tài)為梭形，其生長(zhǎng)曲線呈“S”型，與成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線相似，經(jīng)傳代后(F2代)進(jìn)行誘導(dǎo)分化，利用油紅O染色發(fā)現(xiàn)，在分化第8天出現(xiàn)了標(biāo)志性指環(huán)；分化第10天脂滴變大并融合，且油紅O染色結(jié)果為陽(yáng)性；符合由Ng等[19]和Van等[20]提出的前體脂肪細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，這說(shuō)明利用此法獲得絨山羊羔羊的前體脂肪細(xì)胞是可行的，這為從細(xì)胞生物學(xué)層面研究絨山羊脂肪代謝提供了重要模型。此外，本試驗(yàn)使用的前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑是經(jīng)典的激素雞尾酒，由胰島素、地塞米松和IBMX組成，國(guó)內(nèi)外已有許多報(bào)道[21-22]使用該誘導(dǎo)劑成功誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。但有報(bào)道顯示，脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞也能分化為脂肪細(xì)胞，其功能與前體脂肪細(xì)胞類似[23]，本試驗(yàn)所獲細(xì)胞中或含有少量間充質(zhì)干細(xì)胞，因此，在前體脂肪細(xì)胞的純化以及與間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒別等方面有待開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

A: 成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)第2天；B:成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)第5天；C:成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)第7天；D:成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)第14天。

A: mature adipocytes on day 2 of culture (×100); B: mature adipocytes on day 5 of culture (×100); C: mature adipocytes on day 7 of culture (×200); D: mature adipocytes on day 14 of culture (×200).

圖6成年羊成熟脂肪細(xì)胞的增殖與去分化形態(tài)學(xué)觀察

Fig.6 Morphological observation of proliferation and dedifferentiation of mature adipocytes of adult goats

A: 前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)第6天油紅O鑒定；B:成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)第12天油紅O鑒定。

A: preadipocytes on day 6 of inducement, stained with oil red O (×200); B: mature adipocytes on day 12 of culture, stained with oil red O (×100).

圖7成年羊前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化和鑒定形態(tài)學(xué)觀察

Fig.7 Morphological observation of induced differentiation and identification of preadipocytes of adult goats

脂肪細(xì)胞的數(shù)量在生命早期就已基本確定[5]，隨著動(dòng)物年齡的增長(zhǎng)，前體脂肪細(xì)胞逐漸分化為脂肪細(xì)胞，所以利用膠原酶法直接得到的動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞只適用于胚胎和幼齡動(dòng)物，這使成年動(dòng)物脂肪代謝的機(jī)理研究受到了動(dòng)物年齡的限制。因此，采用成年動(dòng)物的成熟脂肪細(xì)胞去分化法得到前體脂肪細(xì)胞非常必要?！疤旎ò濉狈ㄊ悄壳白顬槌Ｓ玫姆椒?。成熟脂肪細(xì)胞在積聚后會(huì)自動(dòng)發(fā)生去分化形成前體脂肪細(xì)胞[6]，且可通過(guò)自分泌和旁分泌途徑刺激脂肪細(xì)胞分解，阻止前體脂肪細(xì)胞分化，誘導(dǎo)成熟的脂肪細(xì)胞逆分化，以促進(jìn)脂肪細(xì)胞去分化[8]。陳曉煒等[8]用膠原酶分離30～35歲女性腹脂的成熟脂肪細(xì)胞并利用“天花板”法去分化為前體脂肪細(xì)胞；此外，源于平均年齡48.5歲的人眼眶脂肪[24]、12周齡鼠皮下脂肪[16]以及4月齡兔腹股溝脂肪[19]的成熟脂肪細(xì)胞也可通過(guò)“天花板”法去分化獲得前體脂肪細(xì)胞。本試驗(yàn)以成年絨山羊腎周脂肪組織為試驗(yàn)材料，采用與羔羊相同的膠原酶消化法結(jié)合“天花板”法分離培養(yǎng)得到成熟脂肪細(xì)胞后，通過(guò)去分化的方法獲得前體脂肪細(xì)胞，再將前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化得到脂肪細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)原代脂肪細(xì)胞培養(yǎng)2 d時(shí)開(kāi)始貼“天花板”層生長(zhǎng)，第5天時(shí)開(kāi)始呈現(xiàn)梭形，培養(yǎng)14 d時(shí)完全去分化為前體脂肪細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上傳代、誘導(dǎo)分化后，F(xiàn)2代細(xì)胞在分化第12天時(shí)90%以上的細(xì)胞油紅O染色呈陽(yáng)性，說(shuō)明成熟的脂肪細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為前體脂肪細(xì)胞，因此采用“天花板”法獲得絨山羊成年羊的前體脂肪細(xì)胞是可行的。與利用膠原酶消化法直接分離培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞相比，該法獲得的前體脂肪細(xì)胞盡管也有成本相對(duì)較高、培養(yǎng)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，但其純度高，分化能力強(qiáng)且不受動(dòng)物年齡限制，為研究脂肪細(xì)胞的分化與代謝提供了新模型。此外，傳統(tǒng)“天花板”法需使用培養(yǎng)瓶，大量耗費(fèi)培養(yǎng)液，且對(duì)起始細(xì)胞接種量要求較高。Wei等[11]使用多個(gè)培養(yǎng)皿套用的方法進(jìn)行培養(yǎng)，仍較耗費(fèi)培養(yǎng)基。本研究在已有的脂肪細(xì)胞“天花板”培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)瓶培養(yǎng)改進(jìn)為培養(yǎng)皿蓋倒置培養(yǎng)，獲得了前體脂肪細(xì)胞，不僅節(jié)約了培養(yǎng)基、降低了培養(yǎng)成本，且簡(jiǎn)便易行，保證了培養(yǎng)的密閉環(huán)境。

4 結(jié) 論

① 以3月齡阿爾巴斯白絨山羊羔羊腎周脂肪組織為試驗(yàn)材料，采用Ⅰ型膠原酶消化法直接獲得羔羊前體脂肪細(xì)胞。

② 以阿爾巴斯白絨山羊成年母羊腎周脂肪組織為試驗(yàn)材料，采用膠原酶消化法和“天花板”培養(yǎng)法得到成熟脂肪細(xì)胞后，再利用去分化得到成年絨山羊的前體脂肪細(xì)胞是可行的，這為探討絨山羊的脂肪代謝機(jī)理提供了細(xì)胞模型。