二乙烯三胺/一氧化氮聚合物誘導(dǎo)的奶牛外周血 單個核細(xì)胞氧化損傷模型的建立

鄭亞光 齊敬宇 張博綦 史彬林 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

高產(chǎn)奶牛尤其是泌乳高峰期的奶牛，由于較高的營養(yǎng)需求和代謝水平，通常伴隨著自由基類代謝產(chǎn)物的增加。過量的自由基可以誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，造成機體的抗氧化應(yīng)激能力、免疫功能及炎癥應(yīng)答能力下降，使奶牛對疾病的易感性增強。研究表明，從妊娠后期到圍產(chǎn)期和泌乳高峰期，奶牛氧化應(yīng)激水平的進程性提高是導(dǎo)致免疫功能障礙的主要原因[1-2]。因此，深入探討奶牛機體的氧化應(yīng)激發(fā)生機制、減緩氧化應(yīng)激的發(fā)生、提高其免疫功能對保障奶牛的健康生產(chǎn)具有重要的理論與實際意義。一氧化氮(NO)是生物體內(nèi)的一種氣體信號分子和活性氮自由基，存在于多種細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等)中，主要具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)信號傳遞、血壓生理調(diào)控和血小板凝聚抑制等生理功能[3]。研究證實，NO的濃度與機體多種信號通路的活性和炎癥反應(yīng)有關(guān)，低劑量的NO對維持機體免疫功能、血流量、血小板凝集反應(yīng)和神經(jīng)傳遞等內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的生理作用，而過多的NO通常伴隨有炎癥和免疫紊亂。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在生理情況下不表達(dá)，而在炎癥狀態(tài)下iNOS被激活產(chǎn)生大量NO，導(dǎo)致組織損傷，加劇炎癥進程[4]，由此得出，NO的過量產(chǎn)生可能是引起奶牛氧化應(yīng)激產(chǎn)生的原因之一。本課題組的前期研究表明，高劑量二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)使奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并已成功建立NO誘導(dǎo)的BMEC氧化損傷模型[5]。奶牛外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是一類重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，能夠反映機體感染及疾病的發(fā)生，其抗氧化應(yīng)激能力與奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相關(guān)。目前，關(guān)于PBMC氧化應(yīng)激發(fā)生機制的研究報道較少。有研究認(rèn)為，分布于巨噬細(xì)胞的iNOS在機體的免疫應(yīng)答后激活并產(chǎn)生過量的NO，是引起PBMC氧化應(yīng)激和機體炎癥反應(yīng)加劇的原因之一[6]。鑒于此，本研究以DETA/NO為NO供體，篩選NO的作用濃度與作用時間，建立奶牛體外PBMC的NO損傷模型，為通過體外法揭示奶牛PBMC的氧化應(yīng)激機制，進一步緩解高產(chǎn)奶牛氧化應(yīng)激提供基礎(chǔ)性理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PBMC，采用單次密度梯度離心分離法分離培養(yǎng)制備；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司；臺盼藍(lán)、牛PBMC分離液，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；DETA/NO，購自美國Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，購自美國HyClone公司。

1.2 DETA/NO培養(yǎng)液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg DETA/NO溶于612.8 μL的超純水中，配制成濃度為0.1 mol/L的母液，配制方法參照本課題組前期試驗[5]。再將DETA/NO母液按試驗要求配制成不同濃度(0、50、100、200、300、500 μmol/L)的DETA/NO貯備液。取不同濃度的DETA/NO貯備液加入到RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配制成DETA/NO終濃度分別為0、50、100、200、300、500 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液。各細(xì)胞培養(yǎng)液中除DETA/NO濃度不同外，其他成分均相同。將上述細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)22 μm的過濾器過濾，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。

1.3 PBMC的培養(yǎng)

本試驗利用單次密度梯度離心分離法分離培養(yǎng)PBMC，分離培養(yǎng)方法參照天津灝洋TBD牛PBMC分離液說明書。健康奶牛尾靜脈采血后，12 h內(nèi)進行PBMC分離。將血液樣本用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋1倍后，小心地將血液加于牛PBMC分離液上方，15 mL離心管中稀釋后血液與分離液比例為1∶1，400～500×g分離40 min(離心機溫度低于25 ℃,細(xì)胞獲得率高低與室溫有關(guān)，超過25 ℃時會影響細(xì)胞獲得率)，離心后由上至下分為4層，第1層為血漿層，第2層為環(huán)狀乳白色PBMC層，第3層為透明分離液層，第4層為紅細(xì)胞層。吸取第2層，并用PBS重懸清洗細(xì)胞，250×g離心10 min后棄上清，重復(fù)清洗細(xì)胞2次后，將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)68 h后將細(xì)胞離心后收集進行后續(xù)試驗。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h取部分細(xì)胞用臺盼藍(lán)進行染色并計數(shù)活細(xì)胞數(shù)(>95%)

1.4 試驗設(shè)計

試驗分為2個部分。試驗1采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，將細(xì)胞離心后重懸于不同濃度的DETA/NO培養(yǎng)液中，以6×106個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，并隨機分為30個組，每組8個重復(fù)，細(xì)胞培養(yǎng)液中DETA/NO的終濃度分別為0、50、100、200、300、500 μmol/L，并在37 ℃下分別作用2、4、6、8、12 h，通過測定其對細(xì)胞存活率的影響，初步篩選DETA/NO適宜的作用時間，其中以0 μmol/L為對照組。試驗2采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，將培養(yǎng)后得到的PBMC以6×106個/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，并隨機分為6個組，每組6個重復(fù)，細(xì)胞培養(yǎng)液中DETA/NO的終濃度分別為0、50、100、200、300、500 μmol/L，在37 ℃下以試驗1篩選得出的DETA/NO適宜作用時間為DETA/NO的處理時間，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)液抗氧化指標(biāo)和炎癥因子，進一步篩選出DETA/NO的適宜作用濃度，其中以0 μmol/L為對照組。

1.5 樣品采集與處理

將24孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液以重復(fù)為單位，分別收集于1.5 mL Eppendorf離心管中，于4 ℃、10 000×g離心 5 min，收集上清液用于抗氧化指標(biāo)與炎癥因子的測定，樣品采集與處理方法參照本課題組前期相關(guān)試驗[7]。

1.6 測定指標(biāo)與方法

1.6.1 細(xì)胞存活率

采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，以吸光度值反映細(xì)胞的數(shù)量[8]。按照試驗1的試驗設(shè)計將細(xì)胞懸液以6×106個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL的細(xì)胞懸液加入CCK-8的體積為10 μL，避光37 ℃孵育4 h后在波長450 nm處檢測各孔的吸光度值(OD450 nm)，各組的細(xì)胞存活率用相對于對照組OD450 nm的百分比表示。對照組的細(xì)胞存活率表示為100%。

細(xì)胞存活率(%)=(試驗組OD450 nm- 空白組OD450 nm)/

(對照組OD450 nm-空白組OD450 nm)×100。

1.6.2 抗氧化指標(biāo)與炎癥因子

抗氧化指標(biāo)：超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用比色法測定，谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定，操作步驟按照試劑盒說明書進行，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

炎癥因子：NO、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量均采用雙抗體夾心法測定，具體操作按照試劑盒說明書進行，試劑盒購自美國R&D公司。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007進行初步整理，采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA程序進行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 DETA/NO作用濃度與作用時間對PBMC存活率的影響

由表1可以看出，與對照組相比，作用時間為4～12 h時，所有作用濃度的DETA/NO對PBMC存活率均具有顯著的降低作用(P<0.05)，且隨著DETA/NO作用濃度的增加，PBMC存活率呈逐漸的降低趨勢。作用時間為4 h時，DETA/NO作用濃度為50、100 μmol/L時，PBMC存活率組間差異不顯著(P>0.05)，但數(shù)值上有下降的趨勢；DETA/NO作用濃度為200～500 μmol/L時，PBMC存活率隨作用濃度的增加顯著下降(P<0.05)；作用濃度為300、500 μmol/L時PBMC存活率分別為59.3%和47.7%，顯著低于作用濃度為50、100和200 μmol/L時(P<0.05)，作用濃度為50、100和200 μmol/L時PBMC存活率均在70%以上。作用時間為6、8 h的各濃度組中，100～500 μmol/L組作用6 h時PBMC存活率為30.9%～54.1%，作用8 h時PBMC存活率為22.1%～52.6%，均顯著低于對照組和50 μmol/L組(P<0.05)；作用時間為12 h的各濃度組中，100～500 μmol/L組PBMC存活率為22.5%～50.4%，顯著低于對照組和50 μmol/L組(P<0.05)。當(dāng)DETA/NO作用濃度為50 μmol/L時，作用時間分別為2、4、6 h時，PBMC存活率均在80%以上，當(dāng)作用時間延長至8、12 h時，PBMC存活率降低，分別為76.8%、75.8%。當(dāng)DETA/NO作用濃度分別為300、500 μmol/L時，隨著DETA/NO作用時間的延長，PBMC存活率分別由2 h的83.7%、79.5%均降低至60%以下，最低降到22.1%。

2.2 DETA/NO作用濃度對PBMC抗氧化指標(biāo)和炎癥因子的影響

由表2可以看出，不同濃度的DETA/NO作用4 h后，SOD活性隨著DETA/NO作用濃度的增加呈下降趨勢。當(dāng)DETA/NO作用濃度為50 μmol/L時，SOD活性相比對照組差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)DETA/NO濃度為100～500 μmol/L時，SOD活性相比對照組顯著降低(P<0.05)，且DETA/NO作用濃度為200～500 μmol/L時的SOD活性還顯著低于DETA/NO作用濃度為50 μmol/L時(P<0.05)，尤以作用濃度為500 μmol/L時SOD活性最低。GPx和CAT活性呈現(xiàn)與SOD活性相似的變化規(guī)律，MDA含量則呈現(xiàn)與SOD活性相反的變化規(guī)律，且以作用濃度為DETA/NO 500 μmol/L時GPx和CAT活性最低，MDA含量最高。

由表3結(jié)果可以看出，不同濃度的DETA/NO作用4 h后，隨著DETA/NO作用濃度的增加TNF-α含量逐漸升高，以500 μmol/L組TNF-α含量最高；DETA/NO作用濃度為50～500 μmol/L時的TNF-α含量相較對照組均顯著上升(P<0.05)。NO、IL-1、IL-6含量與TNF-α含量呈現(xiàn)相似的變化趨勢，但DETA/NO作用濃度為50 μmol/L時IL-1含量與對照組相比在數(shù)值上呈上升趨勢，但差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

表1 DETA/NO作用濃度與作用時間對PBMC存活率的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same column with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2 DETA/NO作用濃度對PBMC抗氧化指標(biāo)的影響

表3 DETA/NO作用濃度對PBMC炎癥因子含量的影響

3 討 論

NO是生物體內(nèi)的一種氣體信號分子和活性氮自由基，介導(dǎo)多種生物功能，如宿主防御、血管舒張等[9]。NO是由L-精氨酸向L-瓜氨酸轉(zhuǎn)化過程中生成的，并通過一氧化氮合酶(NOS)內(nèi)源合成。巨噬細(xì)胞來源的NO在生理、病理和炎癥反應(yīng)中起重要作用，然而NO的過量產(chǎn)生引發(fā)機體炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激[10]。DETA/NO是人工合成的NO/核苷化合物，無需酶催化便能迅速釋放NO且半衰期長，有利于體外試驗的長時程觀察，是較為理想的外源性NO供體[11]。因此，以DETA/NO為NO供體，誘導(dǎo)PBMC建立氧化損傷模型，可為科學(xué)調(diào)控奶?？寡趸芰皺C制研究提供理想的試驗平臺。

周麗娜等[12]的研究指出，細(xì)胞死亡率為20%～30%可以作為建立小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的評判標(biāo)準(zhǔn)。Huo等[13]報道，在小鼠的心肌細(xì)胞中，選取細(xì)胞存活率為40%～50%作為過氧化氫(H2O2)氧化損傷模型的依據(jù)。孫婧陶等[14]指出，以細(xì)胞死亡率為50%～60%作為建立延邊奶山羊BMEC氧化損傷模型的判別標(biāo)準(zhǔn)。葉新平等[15]在人的體外淋巴細(xì)胞損傷試驗中，使用低濃度乙醇建立了氧化損傷模型，將乙醇對淋巴細(xì)胞的抑制率控制在10%。郭詠梅等[5]在用DETA/NO建立BMEC損傷模型時，將細(xì)胞死亡率控制在20%～30%作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)上述研究報道可知，由于細(xì)胞種類及使用的刺激源不同，細(xì)胞對氧化損傷的耐受能力也不相同，在選擇細(xì)胞損傷標(biāo)準(zhǔn)上也存在差異。

本試驗初步確定將細(xì)胞死亡率控制在20%～30%作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明，當(dāng)DETA/NO作用4 h后，50、100 μmol/L組的PBMC存活率分別為89.9%和87.2%，而200 μmol/L組的PBMC存活率表現(xiàn)出顯著下降，為72.3%。在全部濃度組中以細(xì)胞存活率控制在70%～80%內(nèi)的DETA/NO作用濃度與作用時間可供參考的是：50 μmol/L作用8或12 h，PBMC存活率分別為76.8%和75.8%；200 μmol/L作用 4 h，PBMC存活率為72.3%；500 μmol/L作用2 h，PBMC存活率為79.5%。

DETA/NO作用時間為2 h時，各濃度組的PBMC存活率隨著作用濃度的增加在數(shù)值上有下降的趨勢，除500 μmol/L組PBMC存活率為79.5%外，其余各組PBMC存活率均在80%～90%之間，表現(xiàn)為細(xì)胞在不同濃度的DETA/NO處理下仍保持較好的生長狀況和細(xì)胞活力，即PBMC對DETA/NO的氧化損傷具有較好的耐受性；但考慮到作用濃度過高不適合作為DETA/NO損傷的適宜作用濃度。另外，當(dāng)DETA/NO作用時間為12 h時，盡管50 μmol/L組PBMC存活率為75.8%，但作用時間過長，不便于試驗進行。200 μmol/L DETA/NO作用4 h，可使PBMC存活率降低至72.3%，綜合作用時間不宜過長、作用濃度不宜過高，初步篩選DETA/NO作用4 h即可使PBMC的氧化應(yīng)激達(dá)到較為理想的損傷效果，便于后續(xù)試驗繼續(xù)對DETA/NO的作用濃度進行合理篩選。

活性氧物質(zhì)的生物效應(yīng)在體內(nèi)受到多種酶和非酶防御機制的控制，SOD、CAT、GPx活性及MDA含量可反映出細(xì)胞是否受到氧化損傷以及細(xì)胞的氧化損傷程度[16]。NO、IL-1、IL-6、TNF-α是當(dāng)機體發(fā)生氧化應(yīng)激后產(chǎn)生的常見的炎癥因子，測定這些炎癥因子含量可以進一步反映細(xì)胞氧化損傷的程度[17]。因此，細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立，除了以細(xì)胞存活率作為判別指標(biāo)外，細(xì)胞的抗氧化指標(biāo)和炎癥因子含量的變化也是非常關(guān)鍵的判別指標(biāo)。通過本試驗的結(jié)果可以看出，與對照組相比，當(dāng)DETA/NO作用時間為4 h、作用濃度為100～500 μmol/L時，即可引起SOD、CAT、GPx活性顯著下降，MDA含量顯著升高；當(dāng)DETA/NO作用時間為4 h、作用濃度為50 μmol/L時，即可引起NO、IL-6、TNF-α含量顯著上升。如前所述，引起PBMC存活率達(dá)到70%～80%的DETA/NO作用濃度為200 μmol/L、作用時間為4 h，因此，結(jié)合以上抗氧化指標(biāo)與炎性因子的結(jié)果可以得出，以DETA/NO為外源刺激源作用于PBMC時，當(dāng)其作用濃度為200 μmol/L、作用時間為4 h時，即可引起PBMC的氧化應(yīng)激損傷和抗氧化能力降低，并增強炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

以DETA/NO為刺激源，其在37 ℃下誘導(dǎo)PBMC建立PBMC氧化損傷模型的適宜作用濃度和作用時間分別為200 μmol/L和4 h。