Klotho蛋白對氧化應(yīng)激的影響及可能機(jī)制

常雅琦 文 敏,2 趙 華 陳小玲 田 剛 劉光芒 蔡景義 賈 剛*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，成都611130；2.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，拉薩850000)

研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡受到外界環(huán)境的干擾時，便會發(fā)生氧化應(yīng)激。此時，機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化水平升高，引發(fā)DNA氧化損傷，蛋白質(zhì)表達(dá)異常，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是細(xì)胞乃至個體衰老的一個重要誘因[1-2]，輕則對機(jī)體造成氧化損傷和生產(chǎn)性能下降，重則會誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，影響動物的健康，甚至導(dǎo)致動物發(fā)病和死亡[3]。因此，挖掘和利用具有抗氧化功能的基因和蛋白成為當(dāng)今營養(yǎng)學(xué)家重點關(guān)注的問題。近年來的研究表明，Klotho基因及其蛋白可以提高機(jī)體的抗氧化、抗衰老能力[4]，它是Kuro-o等[5]發(fā)現(xiàn)的一個與人類衰老密切相關(guān)的基因，它在小鼠中的缺失或突變會產(chǎn)生多種類似于人類衰老的表型；相反，該基因的過表達(dá)能夠延長小鼠的壽命[6]，增強(qiáng)小鼠抵抗氧化應(yīng)激能力[4]，表明Klotho是具有抗細(xì)胞凋亡、抗衰老作用的基因。后續(xù)研究表明，Klotho蛋白還具有多種生物學(xué)活性，包括參與鈣磷穩(wěn)態(tài)[7]、抑制炎癥發(fā)生[8]、抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等。本文主要就Klotho蛋白對氧化應(yīng)激的作用及調(diào)控氧化應(yīng)激的可能機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為畜牧生產(chǎn)中通過調(diào)控Klotho的表達(dá)緩解氧化應(yīng)激提供理論依據(jù)。

1 Klotho的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)

1.1 Klotho的發(fā)現(xiàn)

Klotho是Kuro-o等[5]在模擬人類衰老的小鼠模型上鑒定并發(fā)現(xiàn)的新基因，由于它的缺失或突變涉及多種衰老表型，包括生長停滯、壽命縮短、運(yùn)動功能減退、腦垂體畸形、骨質(zhì)疏松、皮膚萎縮等，且小鼠于2月齡死亡，因此以古希臘神話中紡織生命之線女神的名字——Klotho命名[5]，以紡織絲線的長度來喻其壽命的長短。

1.2 Klotho的結(jié)構(gòu)和功能

在人類、小鼠、大鼠的Klotho基因編碼區(qū)有5個外顯子和4個內(nèi)含子，分別轉(zhuǎn)錄3 036、3 042、3 042個堿基的mRNA。另外，在外顯子3區(qū)有一個可變剪接位點，因此小鼠和人類Klotho基因編碼跨膜型和分泌型Klotho蛋白[5,9]。小鼠Klotho基因定位于染色體的13q12，其啟動子區(qū)缺乏TATA盒[10]，Klotho啟動子中缺失的TATA盒與腎特異性鈣黏蛋白(Ksp-cadherin)啟動子相似[10]。Klotho的mRNA存在一個可變剪切位點，因此Klotho可產(chǎn)生2種蛋白：一種是跨膜型Klotho蛋白，它由1 014個氨基酸組成，包括N末端信號序列、C末端跨膜結(jié)構(gòu)域和短的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域以及胞外結(jié)構(gòu)域[11]?？缒ば蚄lotho蛋白與成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)作為成纖維細(xì)胞生長因子23(FGF23)的共受體，介導(dǎo)FGF23發(fā)揮生物學(xué)活性，從而調(diào)節(jié)磷代謝穩(wěn)態(tài)[12]。另一種是分泌型Klotho蛋白，它由550個氨基酸組成，只含有N末端信號序列和胞外區(qū)KL1，無胞外區(qū)KL2、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)[11]。分泌型Klotho蛋白可以抵抗炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)生長激素的分泌[13]、抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等。

1.3 Klotho基因的表達(dá)

小鼠的Klotho基因在腎臟中高表達(dá)，在垂體、胎盤、骨骼肌、膀胱、胰腺、睪丸、卵巢、結(jié)腸及內(nèi)耳等組織中低表達(dá)[14-16]，以編碼跨膜型Klotho蛋白為主[17]；大鼠的Klotho基因在腎臟中高表達(dá)，在腦、肺臟、直腸和性腺等組織中低表達(dá)[9,18]，編碼跨膜型Klotho蛋白；人的Klotho基因主要表達(dá)于腎臟，在胎盤、前列腺和小腸等組織中低表達(dá)，主要編碼分泌型Klotho蛋白[14,17]。Hsu等[19]在對小鼠上皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇處理細(xì)胞中Klotho基因和蛋白呈劑量和時間依賴性顯著增加；Mizuno等[20]利用離體試驗中研究了甲狀腺激素對KlothomRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素可呈劑量和時間依賴性顯著增加3T3-L1脂肪細(xì)胞中跨膜型KlothomRNA的表達(dá)水平，而分泌型KlothomRNA的表達(dá)水平有上升趨勢但不顯著；此外，在成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟中，KlothomRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，預(yù)示著FGF2過表達(dá)可能增加Klotho基因和蛋白的表達(dá)[21]。

2 Klotho蛋白對氧化應(yīng)激的影響

二氫乙啶(dihydroethidium,DHE)可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)氧化，產(chǎn)生紅色熒光。Wang等[22]通過構(gòu)建含Klotho基因的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入大鼠主動脈平滑肌(RASM)細(xì)胞中使Klotho基因在細(xì)胞中得到表達(dá)，并通過DHE氧化來評估RASM細(xì)胞中超氧化物的產(chǎn)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因組細(xì)胞內(nèi)超氧化物的水平顯著低于對照組；他們還用血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞超氧化物的產(chǎn)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因組細(xì)胞內(nèi)超氧化物的水平同樣顯著低于對照組。由此可見，Klotho蛋白可降低細(xì)胞內(nèi)超氧化物水平，進(jìn)而緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激。

機(jī)體在有氧代謝過程中產(chǎn)生一系列ROS，對大多數(shù)細(xì)胞具有毒性作用，當(dāng)機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和ROS的清除失衡時，就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激。Song等[23]分別用異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)、ISO與Klotho蛋白刺激H9c2心肌細(xì)胞，并用7′-二氯熒光素(7′-dichlorofluorescein，DCF)熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞中ROS水平，其通過流式細(xì)胞儀測量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，ISO組DCF熒光強(qiáng)度顯著升高，Klotho蛋白組顯著降低ISO誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度的升高；他們還分別給小鼠注射ISO、ISO與Klotho蛋白，并用DHE ROS檢測法檢測小鼠心臟ROS的產(chǎn)生，結(jié)果與心肌細(xì)胞的結(jié)果相同，Klotho蛋白顯著降低ROS的產(chǎn)生。因此，Klotho蛋白可以顯著降低ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而減緩細(xì)胞或機(jī)體的氧化應(yīng)激。

Yamamoto等[4]通過試驗證明Klotho蛋白可以抵抗氧化應(yīng)激：百草枯是一種可以產(chǎn)生超氧化物的化學(xué)物質(zhì)，在Hela細(xì)胞中添加百草枯并用熒光探針檢測脂質(zhì)氧化程度，發(fā)現(xiàn)添加Klotho蛋白的細(xì)胞中脂質(zhì)氧化程度降低；給Klotho轉(zhuǎn)基因小鼠注射致死劑量的百草枯后發(fā)現(xiàn)野生型小鼠的存活率顯著低于轉(zhuǎn)基因小鼠；尿8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是體內(nèi)DNA氧化損傷的生物學(xué)標(biāo)志，研究發(fā)現(xiàn)Klotho轉(zhuǎn)基因小鼠的尿8-OHdG含量顯著低于野生型小鼠。因此，無論是體內(nèi)試驗還是體外試驗，都證明Klotho蛋白可以增加機(jī)體對氧化應(yīng)激的抵抗。

錳超氧化物歧化酶(MnSOD或SOD2)可以清除超氧陰離子自由基(O2-·)，提高機(jī)體抗氧化能力。他克莫司(tacrolimus，Tac)可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，用免疫熒光檢測法檢測小鼠腎臟中SOD2的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Tac處理顯著降低了小鼠腎小管細(xì)胞線粒體SOD2的表達(dá)量，且這種作用被Klotho蛋白顯著抑制[24]。因此，Klotho蛋白可上調(diào)SOD2的表達(dá)，增強(qiáng)其清除有害自由基的能力，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。大量研究表明，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，相反，通過檢測凋亡基因的表達(dá)可以反映出機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白抑制了Tac誘導(dǎo)的抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)；通過Tac處理后，促凋亡標(biāo)志物Bax、半胱天冬酶9(Caspase-9)和半胱天冬酶3(Caspase-3)的表達(dá)量顯著增加，且它們在Klotho蛋白處理的細(xì)胞中顯著降低[24]。因此，Klotho蛋白可通過調(diào)控抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡標(biāo)志物Bax、Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，進(jìn)而反映氧化應(yīng)激的狀態(tài)。

3 Klotho蛋白調(diào)控氧化應(yīng)激的可能機(jī)制

3.1 通過激活叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O(FoxO)

叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(Fox)基因即Forkhead，廣泛存在于從酵母到哺乳類真核生物中，其源于果蠅的“叉頭”突變，目前已發(fā)現(xiàn)的Fox基因都具有Forkhead保守區(qū)。FoxO是胰島素(INS)/胰島素樣生長因子-1(IGF-1)信號通路中重要的信號分子，對下游靶基因的表達(dá)起到負(fù)調(diào)控的作用。那么，F(xiàn)oxO與氧化應(yīng)激之間是怎樣的關(guān)系呢？已知4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen，4-OHT)具有激活轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a的作用，Kops等[25]用過氧化氫(H2O2)處理DL23靜止細(xì)胞50 min后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)4-OHT處理過的細(xì)胞的氧化程度(ROS水平)較低；而在癌細(xì)胞DLD-1中發(fā)現(xiàn)，其氧化程度(ROS水平)非常高，該結(jié)果說明細(xì)胞內(nèi)氧化程度(ROS水平)的降低可通過激活FoxO3a來實現(xiàn)。Kops等[25]進(jìn)一步研究了經(jīng)過4-OHT處理的DL23細(xì)胞中SOD2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平隨著時間的推移而增加。由此可見，F(xiàn)oxO可通過提高SOD2的表達(dá)水平、降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平而抑制氧化應(yīng)激，那么如何激活FoxOs則是至關(guān)重要的。

Klotho蛋白可通過降低FoxO的磷酸化，促進(jìn)其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移來激活FoxO，也可提高FoxO的轉(zhuǎn)錄活性并促進(jìn)其下游靶基因SOD2的表達(dá)。Yamamoto等[4]用Klotho蛋白刺激Hela細(xì)胞，觀察到該蛋白以劑量依賴的方式降低了絲氨酸-蘇氨酸激酶(Akt)和FoxO1磷酸化的基礎(chǔ)水平；蛋白質(zhì)微陣列分析表明Klotho蛋白抑制了Akt和FoxO1的基礎(chǔ)磷酸化水平和胰島素誘導(dǎo)的Akt和FoxO1的磷酸化水平，同樣也抑制了FoxO3a和FoxO4的磷酸化水平；此外，他們還用免疫組織化學(xué)分析檢測了Klotho蛋白誘導(dǎo)的FoxO磷酸化下降是否與其核轉(zhuǎn)位相關(guān)，結(jié)果表明Klotho蛋白促進(jìn)FoxO1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核；同時，免疫印跡分析證實，Klotho蛋白以劑量依賴的方式顯著增加核內(nèi)的FoxO1水平。這些觀察結(jié)果表明Klotho蛋白信號可引起FoxO的核轉(zhuǎn)位。Yamamoto等[4]通過使用含有3個典型的FoxO結(jié)合位點的熒光素酶報告基因(FHRE-Luc)和含有人SOD2基因啟動子的SOD2-Luc來測量FoxO的轉(zhuǎn)錄活性，將其轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白顯著增加了報告基因和SOD2基因啟動子的表達(dá)；染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(ChIP)被用來確定轉(zhuǎn)錄因子FoxO1是否結(jié)合到SOD2的啟動子，結(jié)果表明Klotho蛋白處理顯著增加了與SOD2基因啟動子結(jié)合的FoxO1的量且Klotho蛋白可促進(jìn)SOD2基因的表達(dá)。綜上所述，Klotho蛋白可激活FoxO，其具體途徑如下。

3.1.1 Klotho蛋白通過抑制INS/IGF-1信號通路激活FoxO

脊椎動物FoxO亞家族成員可進(jìn)一步分為FoxO1、FoxO3a和FoxO4，INS/IGF-1信號通路對其具有負(fù)調(diào)控的作用，具體途徑見圖1[26]。INS/IGF-1信號通路引起Akt的磷酸化和激活并導(dǎo)致FoxO的磷酸化，磷酸化的FoxO從細(xì)胞核中移除且失活。因此，如何抑制INS/IGF-1的信號通路是問題的關(guān)鍵。Kurosu等[6]用免疫沉淀和免疫印跡的方法研究了Klotho蛋白對細(xì)胞內(nèi)INS/IGF-1信號通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白對該信號通路具有抑制作用。因此，Klotho蛋白可通過抑制INS/IGF-1信號通路激活FoxO。

3.1.2 Klotho蛋白通過抑制p53/p21信號通路提高FoxO的轉(zhuǎn)錄活性

P21基因是位于p53基因下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子，它可以和p53共同構(gòu)成細(xì)胞周期G1檢查站，減少損傷DNA的復(fù)制和積累，從而發(fā)揮抑癌作用[27]。Miyaguchi等[28]在COS-7細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)p53與FoxO3a之間可以相互作用。由于蛋白與蛋白之間的相互作用會影響FoxO的轉(zhuǎn)錄活性，因此有必要了解p53和FoxO在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合是否影響FoxO的轉(zhuǎn)錄活性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：p53抑制FoxO3a的轉(zhuǎn)錄活性，而FoxO3a不影響p53。氧化應(yīng)激與許多病理生理過程關(guān)系密切，是細(xì)胞衰老的一個重要誘因。Ikushima等[29]研究了Klotho蛋白是否可以減少過氧化氫誘導(dǎo)的人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)衰老以及p53、p21的表達(dá)，結(jié)果表明Klotho蛋白處理的細(xì)胞衰老減弱且p53、p21的表達(dá)降低。因此，Klotho蛋白可通過抑制p53/p21信號通路進(jìn)而提高FoxO的轉(zhuǎn)錄活性。

Insulin：胰島素；IGF-1：胰島素樣生長因子-1 insulin-like growth factor-1；receptor：受體；AKT：蛋白激酶B protein kinase B；FoxO：叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O Forkhead box O；SOD2：錳超氧化物歧化酶 manganese superoxide dismutase；Catalase：過氧化氫酶。

圖1Klotho蛋白與INS/IGF-1信號通路的關(guān)系示意圖

Fig.1 Schematic diagram of the relationship between Klotho protein and INS/IGF-1 signaling pathway[26]

3.1.3 Klotho蛋白通過負(fù)調(diào)控磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路提高FoxO的轉(zhuǎn)錄活性

FoxO是PI3K/AKT信號通路的下游轉(zhuǎn)錄因子，用以調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)，途徑見圖2[30]。Sun等[24]使用HK-2細(xì)胞全細(xì)胞裂解物的免疫印跡分析，結(jié)果顯示Tac處理激活PI3K/AKT信號通路，從而增加FoxO3a的磷酸化(導(dǎo)致失活或保留在細(xì)胞質(zhì))和SOD2表達(dá)的降低，而Klotho蛋白處理后可降低FoxO3a的磷酸化且SOD2的表達(dá)升高。

綜上所述，Klotho蛋白可通過抑制INS/IGF-1、p53/p21、PI3K/AKT信號通路來激活FoxO，降低ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)抗氧化靶基因的表達(dá)，從而緩解氧化應(yīng)激。

3.2 Klotho通過激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路調(diào)節(jié)NADPH氧化酶(Nox)2蛋白的表達(dá)

最近的研究表明，Nox是脈管系統(tǒng)中ROS的主要來源[31]，Nox2(gp91phox)及其同系物(Nox1、Nox4和Nox5)是Nox的催化亞基。Wang等[22]研究表明，Klotho基因轉(zhuǎn)移降低了大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞中Nox2蛋白的表達(dá)，從而降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。Wang等[22]研究還發(fā)現(xiàn)Klotho基因轉(zhuǎn)移可劑量依賴性地增加大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平和蛋白激酶A(PKA)的活性，降低Nox2蛋白的表達(dá)；而加入cAMP抑制劑后，PKA的活性降低，Nox2蛋白的表達(dá)升高。因此，Klotho蛋白通過cAMP/PKA信號途徑降低Nox2蛋白的表達(dá)。

Growth factor：生長因子；receptor：受體；PI3K：磷酯酰肌醇3-激酶 phosphoinositide 3-kinase；AKT：蛋白激酶B protein kinase B；FoxO：叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O Forkhead box O；○P：磷酸化 phosphorylation；ROS detox. 活性氧去除 reactive oxygen species detoxification；SOD2：錳超氧化物歧化酶 manganese superoxide dismutase；Catalase：過氧化氫酶；Nucleus：細(xì)胞核。

圖2Klotho蛋白通過PI3K-AKT信號通路調(diào)控FoxO示意圖

Fig.2 Schematic diagram of regulation of Klotho protein on FoxO by the PI3K-AKT signaling pathway[30]

3.3 Klotho通過激活Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路發(fā)揮抗氧化作用

Keap1-Nrf2信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化通路之一。據(jù)報道，Klotho基因的過表達(dá)可導(dǎo)致核Nrf2的增加和ARE的活化[32]，而ARE可調(diào)控血紅素氧合酶1(HO-1)和過氧化物酶-1(Prx-1)的啟動子區(qū)域。血紅素氧合酶(HO)和過氧化物酶(Prx)都是一種廣泛存在的抗氧化酶，在機(jī)體抗氧化過程中發(fā)揮重要作用[33]。Maltese等[34]研究了Klotho是否有增強(qiáng)人主動脈平滑肌細(xì)胞的抗氧化防御作用，結(jié)果表明，Klotho蛋白以劑量依賴的方式顯著增加Nrf2、HO-1和Prx-1的表達(dá)；此外，用沉默RNA(siRNA)敲減Nrf2后顯著減弱了Nrf2、HO-1和Prx-1的表達(dá)。

4 小 結(jié)

Klotho基因在動物體內(nèi)呈多組織表達(dá)特性，它主要調(diào)節(jié)機(jī)體的抗衰老、抗氧化能力。本文綜述了Klotho蛋白對氧化應(yīng)激的作用及調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化應(yīng)激的可能分子機(jī)制，其作用機(jī)理涉及到FoxO、cAMP信號通路以及Keap1-Nrf2/ARE信號通路。氧化應(yīng)激可造成動物生產(chǎn)過程中的巨大損失，而Klotho蛋白的發(fā)現(xiàn)及探究其作用機(jī)理可為開發(fā)新型抗氧化劑、抗炎劑提供理論基礎(chǔ)，是否可以通過開發(fā)Klotho蛋白的過表達(dá)產(chǎn)品來緩解動物氧化應(yīng)激、動物對Klotho蛋白是否可以消化吸收還有待深入的研究。此外，有必要進(jìn)一步研究Klotho蛋白在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用，進(jìn)而通過調(diào)控Klotho基因表達(dá)來對衰老及衰老相關(guān)疾病提供新的治療方法。