30個(gè)Y-STR基因座在中國漢族人群中的多態(tài)性與突變

吳微微 ，蘇艷佳 ，梅興林，呂德堅(jiān)，周 翔，郝宏蕾，任文彥，劉 冰

（1.浙江省公安物證鑒定中心 浙江省刑事科學(xué)技術(shù)應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310009；2.浙江安寧生物科技有限公司，浙江 嘉興 314000；3.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510089；4.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

Y 染色體 STR（Y chromosome short tandem repat，Y-STR）在減數(shù)分裂過程中不發(fā)生重組，為男性所特有，以單倍型形式呈父系遺傳的特點(diǎn)。與常染色體STR基因座相比，Y-STR基因座具有顯著的人群、地域分布特征。因此，Y-STR基因座被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定、混合斑中男性成分的檢測以及族群的起源和遷徙等多個(gè)領(lǐng)域[1-2]。2004年，美國ABI公司推出了Yfiler試劑盒，可以同步擴(kuò)增檢測17個(gè)Y-STR基因座。然而隨著中國Y-STR數(shù)據(jù)庫的建設(shè)，出現(xiàn)了如嫌疑人Y-STR分型與多個(gè)不同家系17個(gè)Y-STR分型匹配，造成嫌疑目標(biāo)過多、排查困難的情況[3]。目前，主流的商業(yè)化Y-STR試劑盒基因座數(shù)量為21～27個(gè)，多個(gè)試劑盒引入了3～7個(gè)快速突變基因座?？焖偻蛔僘-STR基因座的突變率在1×10-2以上，一定程度上提高了Y-STR基因座區(qū)別近親個(gè)體的能力，但是不利于刑事偵查中父系親緣關(guān)系的搜索[4-6]。本研究采用通過六色熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)自行研發(fā)的由30個(gè)中低突變率、具有中高識(shí)別能力的Y-STR基因座組成的復(fù)合擴(kuò)增體系[7]，對(duì)中國漢族人群1005名男性無關(guān)個(gè)體和1008對(duì)支持親子關(guān)系的父子進(jìn)行分型，調(diào)查該30個(gè)Y-STR基因座在中國漢族男性人群中的等位基因頻率、基因多態(tài)性、單倍型及其突變情況，為群體遺傳學(xué)和Y-STR數(shù)據(jù)庫建設(shè)等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

用經(jīng)典型血樣采集卡（長春博坤生物科技有限公司）采集中國漢族人群1 005名男性無關(guān)個(gè)體和1008對(duì)父子（1949份血樣，其中1父1子的877例，1父2子的61例，1父3子的3例）的血液樣本，案例均為本實(shí)驗(yàn)室日常檢案與建庫積累。所有父子關(guān)系樣本均經(jīng)常染色體STR檢驗(yàn)支持親子關(guān)系。

1.2 主要儀器與試劑

Freedom EVO?150-8全自動(dòng)化液體處理工作站（瑞士Tecan公司），9700型PCR儀、3500xL基因分析儀（美國AB公司），1.2mm打孔器（美國Harris公司）。

數(shù)據(jù)庫專用磁珠法DNA提取試劑盒（長春博坤生物科技有限公司），去離子甲酰胺（美國Thermo Fisher Scientific公司），C-Taq DNA聚合酶、內(nèi)標(biāo)SIZ-500（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司），男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948（美國Promega公司）。

1.3 DNA提取

本研究中，有350份樣本在全自動(dòng)化工作站上采用磁珠法提取DNA，其余樣本采用血卡直接擴(kuò)增的方法。

1.4 PCR擴(kuò)增

使用9700型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10μL，包含4μL反應(yīng)混合物、2U C-Taq DNA聚合酶、2μL引物混合物以及0.5～2 ng DNA提取樣本或1.2 mm血卡，剩余體積用去離子水補(bǔ)足。熱循環(huán)參數(shù)：95℃2min；94℃ 15s，60℃ 1min，69℃ 1min，30 個(gè)循環(huán)；60℃ 15min；4℃保溫。

1.5 電泳及分型

取1μL PCR 產(chǎn)物、9.5 μL 去離子甲酰胺和0.5μL內(nèi)標(biāo)SIZ-500，混勻，95℃保溫3min并立即冰浴3min。使用3500xL基因分析儀以1.2kV、28s的進(jìn)樣模式進(jìn)行電泳。電泳數(shù)據(jù)通過GeneMapperTMIDX v1.4軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行等位基因分型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算1 005名男性無關(guān)個(gè)體各基因座等位基因與單倍型檢出頻率，基因多樣性（GD）和單倍型多樣性（HD）的計(jì)算公式為：

式（1）中，n為樣本數(shù)，Pi為等位基因頻率或單倍型頻率；

單倍型識(shí)別能力（DC）的計(jì)算公式為：

式（2）中，H為單倍型種數(shù)，N為樣本數(shù)。

分析1008對(duì)父子關(guān)系樣本Y-STR基因座分型，統(tǒng)計(jì)等位基因傳遞次數(shù)與突變次數(shù)，其中多拷貝基因座的等位基因傳遞次數(shù)統(tǒng)計(jì)為相應(yīng)拷貝數(shù)。根據(jù)網(wǎng)站（http://statpages.org/confint.html）的方法計(jì)算突變率以及 95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。

2 結(jié) 果

2.1 遺傳多態(tài)性

1005名漢族男性無關(guān)個(gè)體30個(gè)Y-STR基因座共檢出983種單倍型，其中963種為單一分型，18種檢出兩次，2種檢出3次?？傮wHD值為0.999955，DC值為0.978109。

30個(gè)Y-STR基因座共檢出340個(gè)等位基因，各基因座中GD值最高為DYS385a/b（0.952 3），最低為DYS391（0.4103）。除了 DYS389Ⅰ、DYS438、DYS391、DYS437、GATA_H4和DYS549基因座外，其余基因座的GD值均大于0.6，各基因座等位基因頻率分布情況及GD值見表1～2。

表1 30個(gè)Y-STR基因座在中國漢族男性人群中的等位基因頻率分布 （n=1005）

續(xù)表1

表2 30個(gè)Y-STR基因座在中國漢族男性人群中的GD值 （n=1005）

2.2 等位基因突變

1008對(duì)父子樣本30個(gè)Y-STR基因座分型中共檢測到30269次等位基因的遺傳傳遞，其中在26個(gè)基因座上共發(fā)現(xiàn)74次突變，平均突變率為2.4×10-3，95%CI為（1.9×10-3，3.1×10-3）。其中突變率最高是DYS557，為 5.0×10-3，95%CI為（1.6×10-3，11.6×10-3），突變率最低的是 DYS392、DYS438、DYS587、DYS460、DYS643、DYS635 和 DYS443，為 1.0×10-3，95%CI為（0，5.5×10-3）。 而 DYS19、DYS437、DYS448 和 DYS520 4個(gè)基因座未發(fā)現(xiàn)突變。各基因座的突變情況見表3。

突變共涉及71對(duì)父子，其中68對(duì)突變僅在1個(gè)基因座上，3對(duì)突變同時(shí)發(fā)生在2個(gè)基因座上。在檢出的74次突變中，一步突變73次（98.6%），兩步突變1次（1.4%），為GATA_H4中14突變?yōu)?2。突變時(shí)等位基因增加重復(fù)單位數(shù)50次（67.6%），減少重復(fù)單位數(shù)24次（32.4%）。發(fā)生兩步突變和2個(gè)基因座同時(shí)突變的父子關(guān)系樣本，結(jié)合相應(yīng)母親樣本，經(jīng)41個(gè)常染色體STR檢驗(yàn)均確認(rèn)為父子關(guān)系。

表3 30個(gè)Y-STR基因座在中國漢族男性人群中的突變情況

3 討 論

DNA技術(shù)在法庭科學(xué)中可以起到排查或個(gè)體識(shí)別的作用。相對(duì)于常染色體STR基因座，Y-STR基因座單倍型在個(gè)體識(shí)別方面的識(shí)別力較低，不能作為唯一性個(gè)體識(shí)別的手段，只能起到輔助作用[8]。但是YSTR基因座呈父系遺傳，同一父系個(gè)體具有相同分型的特點(diǎn)使得其適用于推斷父系個(gè)體嫌疑人，通過搜索Y-STR數(shù)據(jù)庫可以排查同一父系的犯罪嫌疑人。目前商品化Y-STR試劑盒主要有Yfiler、Yfiler Plus和PowerPlex Y23等，包含基因座數(shù)量分別為17、27和23個(gè)，其中Yfiler Plus、PowerPlex Y23試劑盒包含了3～7個(gè)快速突變基因座，這些快速突變的Y-STR基因座有利于將近親個(gè)體如父子或兄弟區(qū)別開來[9]，但容易使同一父系個(gè)體出現(xiàn)不同的單倍型。所以，快速突變基因座在父系親緣關(guān)系鑒定中容易造成有親緣關(guān)系男性個(gè)體的錯(cuò)誤排除，不利于通過家系搜索來偵查破案。本研究30個(gè)Y-STR基因座中，突變率最高為 5.0×10-3（DYS557），不含有快速突變基因座，平均突變率為 2.4×10-3，95%CI為（1.9×10-3，3.1×10-3），在既往報(bào)道[5]的46個(gè)Y-STR基因座的突變率范圍［平均為 4.1×10-3，95%CI為（3.6×10-3，4.7×10-3）］之外，總體上更具有遺傳穩(wěn)定性，更少發(fā)生突變干擾父系關(guān)系判斷的情況。

本研究30個(gè)Y-STR基因座檢測體系的HD值為0.999955，DC值為0.978109，高于Yfiler試劑盒的17個(gè)Y-STR基因座（HD值和DC值分別為0.999268和0.90908）[2]，更有利于將隨機(jī)個(gè)體區(qū)分開來；但小于46個(gè)Y-STR基因座（HD值和DC值分別為0.99998和0.998 3）[5]，其原因除了基因座數(shù)目少以外，也與46個(gè)Y-STR基因座中含有中、快速突變基因座有關(guān)，因?yàn)閅-STR基因座在減數(shù)分裂中不重組，多態(tài)性的形成主要通過突變，快速突變的基因座往往具有較高的多態(tài)性。

較高的HD和DC意味著更容易將隨機(jī)個(gè)體區(qū)分開來，但是由于STR突變，不同的單倍型并不意味著來自于不同的父系，DC不等于非父排除率（PE）。本研究遺傳學(xué)參數(shù)結(jié)果表明，30個(gè)Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系所用的基因座具有較好的遺傳多態(tài)性和較低的突變率，平衡了多態(tài)性與突變率的關(guān)系，在家系排查中盡可能確保在較高DC的前提下減少了同一家系成員因快速突變基因座造成錯(cuò)誤排除的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究30個(gè)Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系適合中國漢族男性人群的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用與Y-STR數(shù)據(jù)庫的建設(shè)需要。