多套試劑盒在親權(quán)鑒定特殊案例中的應(yīng)用

高洪梅 ，王 昌 ，張珊珊 ，肖東杰 ，孫善會 ，汪運(yùn)山 ，張茂修

（1.山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250013；2.濟(jì)南迪恩法醫(yī)司法鑒定所，山東 濟(jì)南 250013）

常染色體STR基因座由于突變率低、穩(wěn)定遺傳及高度遺傳多態(tài)性而廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個體識別及親權(quán)鑒定[1]。目前常染色體親權(quán)鑒定試劑盒均包含13個核心STR基因座，但要求檢測系統(tǒng)的累積非父排除率和個體識別率均應(yīng)達(dá)到0.9999以上[2]。目前，基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司推出并廣泛應(yīng)用的常染色體STR試劑盒有Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A、25A和22NC，共包括40個常染色體STR基因座（D5S818、FGA、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E、D22S1045、D2S441、D1S1656、D10S1248、D4S2366、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D7S3048、D5S2500）。 前期研究[3]對 Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A包含的19個常染色體STR基因座在山東漢族人群的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了分析。Y-STR基因座具有獨(dú)特的父系遺傳方式。而對于X染色體，父親的X-STR可遺傳給女兒，母親的X-STR可遺傳給兒子及女兒。目前X-STR和Y-STR在法醫(yī)學(xué)鑒定中應(yīng)用廣泛[4-6]。在親權(quán)鑒定中，當(dāng)有限的常染色體STR基因座檢測出基因突變，在了解案例的遺傳背景前提下，增加檢測X-STR和Y-STR基因座對鑒定意見的出具可起到補(bǔ)充作用。在親權(quán)鑒定案例中，同一個樣本用不同的試劑盒進(jìn)行檢測，可出現(xiàn)個別STR基因座分型結(jié)果不一致，存在等位基因的丟失，這給親權(quán)鑒定結(jié)果的分析帶來風(fēng)險[7-8]。

本研究對常染色體Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)涵蓋的、前期研究[3]尚未分析的其他21個常染色體STR 基因座（D22S1045、D2S441、D1S1656、D10S1248、D4S2366、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D7S3048、D5S2500）在山東漢族人群中的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，同時對用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測存在基因突變可能的案例，增加檢測常染色體STR基因座和X-STR（Y-STR）進(jìn)行分析。另外，對用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A、25A檢測存在等位基因丟失的案例用AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒及樣本測序分析，評估多套試劑盒在親權(quán)鑒定中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

日常鑒定案件中山東漢族人群273份無關(guān)個體的樣本（男性137份，女性136份）用于21個常染色體STR基因座的遺傳學(xué)統(tǒng)計分析。用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測，存在基因突變可能的鑒定案例共6例，其中三聯(lián)體1例，二聯(lián)體5例。另外用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A、25A檢測存在等位基因丟失的案例有3例。樣本采集前均告知當(dāng)事人并征得同意。

1.2 主要試劑與儀器

Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng) 20A、25A、22NC、20Y、17X［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］，AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），DNA標(biāo)準(zhǔn)品采用9947A和9948A。

Hema 9600梯度基因擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），3500xL基因分析儀（美國AB公司）。

1.3 PCR擴(kuò)增和STR基因座分型

采用Chelex-100法提取血樣DNA[9]。對Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng) 20A、25A、22NC、20Y、17X和AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒分別進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3500xL基因分析儀進(jìn)行電泳測序，以試劑盒中相應(yīng)的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物（ladder）為基因分型參照，采用GeneMapperTMID-X v1.3軟件（美國AB公司）進(jìn)行STR基因座分型。對經(jīng)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A、25A檢測存在等位基因丟失的案例進(jìn)行樣本測序，由基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司提供技術(shù)支持。

1.4 統(tǒng)計分析

對273份無關(guān)個體21個常染色體STR基因座采用Cervus 3.0和Power Stats V12軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算21個STR基因座的等位基因頻率、匹配概率（Pm）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、個體識別率（DP）、累積個體識別率（CDP）、非父排除率（PE）、累積非父排除率（CPE），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。本研究案例中父權(quán)指數(shù)（PI）和累積父權(quán)指數(shù)（CPI）的計算參照《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（SF/Z JD0105001—2016），基因突變率男性采用0.002 0，女性采用 0.000 5[2]；D5S818、FGA、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E 共 19 個基因座等位基因頻率采用文獻(xiàn)[3]的數(shù)據(jù)，D22S1045基因座等位基因頻率采用文獻(xiàn)[10]的數(shù)據(jù)，其他20個基因座（D2S441、D1S1656、D10S1248、D4S2366、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D7S3048、D5S2500）等位基因頻率采用文獻(xiàn)[11]的數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 21個常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)

山東漢族人群273份無關(guān)個體21個常染色體STR基因座的等位基因頻率見表1，群體遺傳學(xué)參數(shù)見表2。共得到225個等位基因，通過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，除D4S2366和D2S441基因座外，其他19個STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。21個常染色體STR基因座的CPE為0.9999999979，CDP為 0.9999999999。

表1 山東漢族人群21個常染色體STR基因座的等位基因頻率分布 （n=273）

續(xù)表1

表2 山東漢族人群21個常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù) （n=273）

2.2 突變案例分析

如表3所示，突變案例1為三聯(lián)體鑒定，被檢父與孩子存在2個基因座的基因突變，采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A以及40個常染色體STR基因座檢測，CPI值均＞10 000。如作為父女二聯(lián)體鑒定，Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測CPI值為5.218 4，增加到40個STR基因座檢測，CPI值為6.386 8×106，孩子的X-STR分型均可在父母雙方找到其生物學(xué)來源。

突變案例2～5，被檢母或被檢父與孩子存在一個基因座的基因突變，Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A 檢測的 CPI值：0.0001＜CPI＜10000。增加到 40 個STR基因座檢測，CPI值＞10000，孩子的X-STR或YSTR分型均可在其母親或父親找到其生物學(xué)來源。

突變案例6，采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測時，孩子的D19S433和CSF1PO基因座的分型在被檢父找不到生物學(xué)來源，CPI值為4.811 8×102，而孩子的Y-STR分型與被檢父相同，增加到40個STR基因座檢測，共有6個基因座的分型在被檢父找不到生物學(xué)來源，CPI值為5.1690×10-10。孩子與父親可能來自同一父系，通過常染色體STR分型，可排除被檢父是孩子的生物學(xué)父親。

表3 存在基因突變可能的案例

2.3 等位基因丟失案例分析

表4匯總了3例經(jīng)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A和25A分型并通過AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒確認(rèn)存在等位基因丟失的案例，其中案例1～2經(jīng)過基因測序分析，案例3未進(jìn)行測序分析。

案例1，在D18S51基因座，被檢母及孩子上游引物結(jié)合區(qū)5′端起第8個堿基由G突變?yōu)锳，Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A和25A的相應(yīng)引物無法結(jié)合，導(dǎo)致等位基因19無法檢出。案例2，在D18S51基因座，被檢母及孩子下游引物3′端的四個堿基AAAC丟失，而引物的3′端恰巧最后一個堿基與丟失后的相鄰堿基C不匹配，Taq酶無法有效延伸，導(dǎo)致等位基因12無法檢出。

表4 Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A和25A檢測存在等位基因丟失的案例

3 討 論

親權(quán)鑒定試劑盒均包含13個核心常染色體STR基因座[12-13]，同時需滿足CDP和CPE均大于0.9999。在不同地區(qū)、不同民族，常染色體STR基因座的遺傳多態(tài)性存在一定差異，從而對鑒定案件數(shù)據(jù)的分析帶來一定的影響。本研究統(tǒng)計了山東漢族人群21個常染色體STR基因座的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，其中，D7S3048多態(tài)性最高，D4S2366多態(tài)性最低；DP 為 0.8895～0.9678，PIC 為 0.6903～0.8572，PE 為 0.3786～0.7530，CPE 為0.9999999979，CDP 為 0.9999999999，說明該 21 個常染色體STR基因座在山東漢族人群中具有較高的遺傳多態(tài)性。與前期研究[3]統(tǒng)計的19個常染色體STR基因座聯(lián)合共40個STR基因座，基本滿足日常檢案鑒定的要求。通過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，D4S2366和 D2S441 不符合 Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），可能與樣本的采集及數(shù)量等因素有關(guān)[14]。

常染色體STR基因座平均突變率為0．012 0%～0．2078%，且大部分為一步突變，二步、三步突變相對較少[15-16]。鑒定案件中存在單個或兩個基因座的突變對鑒定意見的出具影響很大[17]。在父-母-子的三聯(lián)體親權(quán)鑒定中，由于有親生母親的遺傳背景，存在突變情況下還比較容易出具鑒定意見。如突變案例1中，父女存在兩個基因座的基因突變：三聯(lián)體鑒定時，采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測的CPI值為3.7519×104；而父女二聯(lián)體鑒定時，CPI值為 5.218 4，當(dāng)增加到40個STR基因座時，CPI值為6.3868×106。在突變案例2～5的二聯(lián)體鑒定案例中，采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測的CPI值均達(dá)不到10000，而增加到40個STR基因座時才能出具支持的鑒定意見。因此，出現(xiàn)基因突變時，二聯(lián)體親權(quán)鑒定對檢測的常染色體STR基因座數(shù)目要比三聯(lián)體親權(quán)鑒定要求多。

目前，X和Y染色體STR基因座檢測對常染色體檢測試劑盒可起到補(bǔ)充作用。出現(xiàn)基因突變時，在了解案例中相關(guān)人員的遺傳背景前提下，建議增加X-STR或Y-STR的檢測，從而保障鑒定意見的準(zhǔn)確性，但不能作為鑒定意見的唯一依據(jù)。突變案例1～5均增加了X或Y染色體STR基因座，孩子的X-STR或Y-STR分型均可在其被檢父或被檢母找到生物學(xué)來源，符合母系或父系遺傳規(guī)律。而在突變案件6中，Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A中共有兩個基因座存在可能的突變，CPI值為4.811 8×102，當(dāng)增加到40個STR基因座檢測時，孩子共有6個STR基因座的分型結(jié)果在被檢父找不到其生物學(xué)來源，CPI值為5.1690×10-10。雖然孩子的Y-STR基因座分型與被檢父相同，說明被檢父與孩子可能來自同一父系，但不是孩子的生物學(xué)父親。

在日常檢案中，個別STR基因座分型出現(xiàn)等位基因的丟失或分型結(jié)果不一致[7-8，18]。本研究發(fā)現(xiàn)3例經(jīng)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A和25A分析，在一個基因座上被檢母和孩子的基因分型存在很大差異，可能存在等位基因的丟失，用AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒檢測進(jìn)行了確認(rèn)。其中2例經(jīng)基因測序分析，在相應(yīng)的引物結(jié)合區(qū)被檢母和孩子存在堿基的突變或丟失，導(dǎo)致相應(yīng)基因座等位基因丟失。如重新設(shè)計PCR引物，避開有問題的堿基位置，可有效解決等位基因丟失現(xiàn)象[19]，也可以先用不同公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行檢測來解決[19-20]。目前，這種等位基因的丟失現(xiàn)象已引起法醫(yī)學(xué)鑒定領(lǐng)域的關(guān)注[21-22]。

綜上所述，本研究提供了山東漢族人群21個STR基因座的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。對部分存在基因突變的二聯(lián)體鑒定案例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A中的23個常染色體STR基因座并不能完全滿足二聯(lián)體鑒定要求，存在基因突變時，建議增加更多的常染色體STR基因座，在了解遺傳背景前提下，同時增加X-STR或Y-STR檢測系統(tǒng)作為補(bǔ)充。對存在等位基因丟失的案例，改用不同公司的試劑盒或進(jìn)行基因測序可以有效解決。