自然發(fā)酵糯玉米中細菌多樣性分析及純菌種對其加工特性的影響

張大力，馮艷鶴，劉炳利，潘 聰，封 玲，鄭明珠*

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

糯玉米起源于中國，其含有人體所需的多種營養(yǎng)成分，蛋白質質量分數約為10.6%，淀粉質量分數為65%～75%，脂肪質量分數為4%～5.5%，還原糖質量分數達到1.6%。又因其分子質量比普通玉米小10 倍多，食用消化率高出20%。營養(yǎng)價值和消化率都超過玉米，所以以糯玉米為主的糯性谷物食品已成為當下餐桌熱點[1]。我國北方冬天具有特色的傳統(tǒng)食品之一的黏豆包正是以糯玉米粉為主要原料，通過自然發(fā)酵的方式制作而成的冷凍食品[2]。但糯玉米碴自然發(fā)酵周期長、微生物菌群復雜，在自然發(fā)酵過程中可能存在腐敗菌甚至致病菌污染的情況，發(fā)酵過程受很多因素影響。

發(fā)酵是微生物活動的一種體現，自然發(fā)酵過程中環(huán)境條件、地域差異的不同，對產品的安全、質構、色澤、風味起著至關重要的作用[3-4]。利用微生物發(fā)酵技術調控和提升產品品質的關鍵在于要了解自然發(fā)酵食品中微生物群落結構，高通量測序方法不僅不需要對微生物進行分離培養(yǎng)，就能夠檢測到較低豐度的微生物，還能更加全面而準確地展示樣品微生物的群落結構[5-6]。

因此，本研究擬對自然發(fā)酵糯玉米碴中的細菌多樣性進行分析，揭示其中的優(yōu)勢菌群，然后對優(yōu)勢菌株進行分離鑒定，獲得優(yōu)勢菌株后進行糯玉米粉的微生物改性處理，比較純種發(fā)酵和自然發(fā)酵對糯玉米粉加工特性的影響。為今后工業(yè)化生產質量穩(wěn)定、健康安全的發(fā)酵糯玉米粉為主要原料的產品提供基本理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯玉米碴由小麥和玉米深加工國家工程實驗室提供。

MRS培養(yǎng)基 美國BD公司；新型微生物微量生化鑒定管 青島賓得生物技術有限公司；E.Z.N.A.Soil DNA Ki美國Omega公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒 美國Life Tech公司；Ep0406 Taq DNA Polymerase 美國Thermo Fisher公司；Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒美國Beckman公司；溶菌酶、蛋白酶K、酚-氯仿-異戊醇溶液、氯仿-異戊醇溶液、Tris、乙二胺四乙酸二鈉、TE緩沖液、十二烷基硫酸鈉、NaCl、瓊脂糖 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；GL-88B旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FW-100高速萬能粉碎機 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；Allegra X-30型離心機 美國Beckman公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國GE公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf公司；RVA-TecMasterTM型快速黏度分析儀 澳大利亞Perten公司；TA-XT plus物性測定儀 英國Stable Micro System公司；Phenom pro型掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom-world公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將糯玉米碴用滅菌的蒸餾水浸泡，使蒸餾水沒過樣品，室溫浸泡96 h后取4 mL液體樣品，分多次加入滅菌的2 mL離心管中，10 000×g離心3 min，棄置上層液體，將離心管倒置直至沒有液體流出。

1.3.2 DNA的提取與PCR擴增

根據CTAB法進行總DNA的快速提取[7]，以提取的總DNA為模板，采用16S rDNA V3～V4區(qū)引物，341F引物：5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3’、（barcode）5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，805R引物：5’-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATT CCA-3’、5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。PCR體系：2×Taq Master Mix 15 μL；Bar-PCR Primer F（10 μmol/L）1 μL；Primer R（10 μmol/L）1 μL；Genomic DNA 10～20 ng；H2O 30 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5 個循環(huán)，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR結束后進行第2輪擴增，反應體系：2×Taq Master Mix 15 μL；Primer F（10 μmol/L）1 μL；Primer R（10 μmol/L）1 μL；Genomic DNA 20 ng， H2O 30 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR結束后，取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 發(fā)酵液中細菌多樣性分析

自然發(fā)酵糯玉米碴中細菌多樣性分析采用MiSeq技術[8-13]，測序由上海生工生物有限公司完成。

1.3.4 發(fā)酵液中乳酸菌分離、純化與初步篩選

乳酸菌的分離采用稀釋涂布平板法：取1 mL發(fā)酵菌懸液，置于9 mL滅菌生理鹽水中，混勻后取1 mL加入另一管9 mL滅菌生理鹽水中，以此類推，將發(fā)酵液稀釋至原液的10-9[14]。取各稀釋度的菌懸液各1 mL分別涂布于平板中，乳酸菌的純化采用劃線分離法：選取在MRS瓊脂培養(yǎng)基中生長并產溶鈣圈的單菌落，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h后。選取產溶鈣圈的單菌落進行革蘭氏染色及過氧化氫酶檢測[15]，符合革蘭氏染色陽性且過氧化氫酶陰性特征即可以初步確定為乳酸菌。

1.3.5 乳酸菌的復篩與16S rDNA鑒定

復篩通過菌株的產酸能力、繁殖能力進行篩選[16]。確定一株產酸能力最快、繁殖能力最佳的菌株命名為FL-0616。將篩選得到的FL-0616菌株提取DNA經測序鑒定。采用SK8255（細菌）基因組提取試劑盒提取FL-0616菌株的基因組DNA[17]，以該DNA為模板，27F引物：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；1492R引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。分別為正向和反向引物，進行PCR擴增[18]，反應體系見1.3.2節(jié)，反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由生工生物工程（上海）有限公司測序。將測序基因序列通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)（http:∥www.ncbi.nlm1nih.gov /Blast.cgi/）進行序列同源性分析，采用鄰接法（Neighbour-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過1 000 次自舉分析（Boostrap）進行置信度檢測。

1.3.6 純菌種發(fā)酵、自然發(fā)酵、未發(fā)酵樣品的預處理

乳酸菌懸液的配制：將鑒定后的乳酸菌進行活化增殖培養(yǎng)，接種于MRS液體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，直到乳酸菌濃度達到5.21×108CFU/mL。

純菌種發(fā)酵：加入已滅菌的蒸餾水，糯玉米碴與蒸餾水的比例為1∶3（g/mL）裝入1 000 mL錐形瓶中，將其混勻后加入分離得到的發(fā)酵乳桿菌菌懸液，菌懸液的接種量為體積分數5%，接種后置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵48 h。自然發(fā)酵：菌懸液用蒸餾水代替，其他條件與純種發(fā)酵一致。未發(fā)酵：取純種發(fā)酵質量相同的糯玉米碴置于37 ℃培養(yǎng)箱中，從烘箱中取出3 種狀態(tài)下的糯玉米碴用高速萬能粉碎機進行干磨制粉，磨粉后的糯玉米粉過80 目篩保存，樣品預處理完成。

1.3.7 糊化特性的測定

向快速黏度分析儀測量筒中加入25 mL水，分別取3 種方式下的糯玉米粉3.00 g，用攪拌槳攪動20 s，攪拌均勻即可開始測量。在測量時起始溫度設定為50 ℃，維持1 min；在3.9 min內升溫至96 ℃；保持2 min；然后在3.5 min內降溫至50 ℃，并保持1.5 min[19]。

1.3.8 熟面團質構特性的測定

采用質構儀測定樣品質構，取3 種方式下的糯玉米粉20 g，加入80%的蒸溜水分別制成厚度約為0.5 cm生面團，蒸熟后進行測定。物性儀選用的探頭為P/36R，測定的條件為[20]：測量前速率1.00 mm/s；測量速率2.00 mm/s；測量后速率2.00 mm/s；壓縮率50.00%；壓縮程度70%；兩次壓縮間隔5 s；強制觸發(fā)力5.0 g，觸發(fā)距離2.00 mm。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

樣品黏在樣品臺上，經真空噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察并采集圖像（×5 000）。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵液中細菌多樣性分析

圖1 細菌多樣性Fig. 1 Bacterial diversity of fermentation broth

如圖1所示，自然發(fā)酵的菌液中菌群組成為：乳桿菌屬（Lactobacillus）65.14%、腸桿菌屬（Enterobacter）23.85%、魏斯氏菌屬（Weissella）7.09%、明串珠菌屬（Leuconostoc）0.9%、未分類（unclassified）0.96%、克雷伯菌屬（Klebsiella）0.45%、微小桿菌屬（Exiguobacterium）0.42%、勒克菌屬（Leclercia）0.23%、不動桿菌屬（Acinetobacter）0.19%、腸球菌屬（Enterococcus）0.14%、銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas）0.14%、泛菌屬（Pantoera）0.14%、葡萄球菌屬（Staphylococcus）0.14%。研究結果表明，乳桿菌屬是自然發(fā)酵菌液中的優(yōu)勢菌屬。

2.2 乳酸菌的生理生化及16S rDNA分析

2.2.1 細菌生理生化鑒定

圖2 分離株（A）及其革蘭氏染色（B）（×400）Fig. 2 Isolates (A) and Gram staining (B) (× 400)

如圖2所示，菌落顏色為乳白色、凸起不透明、光滑濕潤、邊緣整齊、無芽孢桿狀、直徑在1.0～2.0 mm、革蘭氏染色呈陽性，排列方式為單個或多個短鏈。

2.2.2 菌株液體培養(yǎng)基的最終pH值與生長量測定結果

圖3 各菌株培養(yǎng)過程中菌液pH值與菌株生長量的變化Fig. 3 Change in pH value and growth rate of six selected isolates

對篩選得到的6株符合革蘭氏染色陽性過氧化氫酶陰性的菌株測定其pH值和生長曲線。由圖3可知，菌株的pH值在24 h內下降均比較明顯，菌體生長速率在18 h左右達到最大值。但菌株FL-0616的pH值最低3.87，OD600nm為2.155，更加適合做發(fā)酵劑，因此對其進行16S rDNA鑒定。

表1 FL-0616細菌生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical identification of FL-0616

由表1可知，經過篩選得到的菌株FL-0616能夠發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖及阿拉伯糖，對果糖與麥芽糖呈弱陽性反應。在明膠液化、V-P實驗、吲哚實驗、硝酸酸鹽還原實驗、硫化氫等實驗中均呈陰性反應。通過參照文獻[21-22]初步認定菌株FL-0616為發(fā)酵乳桿菌。

2.2.3 分子生物學鑒定

圖4 菌株FL-0616片段DNA的PCR擴增電泳圖Fig. 4 PCR amplification of DNA fragment from strain FL-0616

如圖4所示，菌株FL-0616擴增產物序列長度為1 435 bp，與預期結果一致。根據FL-0616的16S rDNA序列與NCBI數據庫上Lactobacillus fermentum（MF3551691.1）、L. ingluviei（AB911500.1）、L. equigenerosi（NR041566.1）等不同種乳桿菌構建系統(tǒng)發(fā)育樹，圖5結果顯示FL-0616與發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）自然聚為一支，且自展值為100，綜合形態(tài)學觀察，生理生化特征及分子生物學序列分析，最終確定菌株FL-0616為發(fā)酵乳桿菌。

圖5 FL-0616系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of FL-0616

2.3 糊化特性分析

表2 不同發(fā)酵方式糯玉米粉糊化特性Table 2 Pasting characteristics of waxy corn flour fermented with different strains

由表2可見，兩種方式均可顯著提高糯玉米粉的峰值黏度，自然發(fā)酵和純菌種發(fā)酵分別提高1 480 cP和1 565 cP。峰值黏度反映淀粉顆粒的膨脹性能，而影響淀粉膨脹性能的因素為支鏈淀粉的分子結構、淀粉的親水性，乳酸菌純菌種發(fā)酵使支鏈淀粉的含量降低，而中間及短鏈的支鏈淀粉含量相對增加，且發(fā)酵使蛋白質、脂肪明顯減少，淀粉顆粒在糊化的過程中更易吸水膨脹至更大的體積，故峰值黏度增加[23]。自然發(fā)酵和純菌種發(fā)酵對糯玉米粉的衰減值分別顯著提高了834 cP和864 cP，衰減值可以評價淀粉熱糊的穩(wěn)定性，衰減值越大，表明淀粉顆粒越不穩(wěn)定，其顆粒內部分子間結合力減弱，這使得顆粒更容易在剪切作用下發(fā)生破裂和瓦解[24]。自然發(fā)酵和純菌種發(fā)酵對糯玉米粉的回生值分別顯著降低了132 cP和195 cP，回生值可以評價淀粉的抗老化性能，回生值小，抗老化性能提高[25]。由于糯玉米的胚乳中100%的淀粉是支鏈淀粉，支鏈淀粉的平均外支鏈長度對糯玉米粉回生速率有重要影響，隨著發(fā)酵的進行，支鏈淀粉的分支被適度降解，使回生速率降低[26-28]。綜上所述，純菌種發(fā)酵和自然發(fā)酵都能夠對糯玉米粉起到一定的改性作用。與自然發(fā)酵相比，乳酸菌發(fā)酵顯著提高糯玉米粉峰值黏度，降低回生值，改性效果較好。

2.4 質構特性分析

表3 不同發(fā)酵方式糯玉米粉質構特性Table 3 Texture characteristics of waxy corn flour fermented with different strains

自然發(fā)酵和乳酸菌純菌種發(fā)酵對糯玉米粉的硬度、黏附性、膠著性等質構特性均產生了明顯的影響。由表3可知，乳酸菌純菌種發(fā)酵將糯玉米粉的硬度提高1 070 g，而自然發(fā)酵可提高275 g。硬度是描述與食品變形或穿透產品所需的力有關機械質地特性，是食品保持形狀的內部結合力[29]，發(fā)酵能夠提高糯玉米粉熟面團的硬度可能是由于自然發(fā)酵液中乳酸菌生長代謝利用了糯玉米粉的營養(yǎng)物質，降低蛋白含量并促進支鏈淀粉短鏈的水解從而導致淀粉凝膠網絡結構加強[30]。乳酸菌發(fā)酵將糯玉米粉的黏附性提高332、膠著性提高600，黏附性和膠著性的增大表明面團更有韌性，在一定程度上補充了糯玉米粉類食品相對缺乏黏彈性的缺點。咀嚼性在數值上等于硬度、彈性、內聚性的乘積，原則上咀嚼性的變化受到3個因素的影響，但表中彈性和內聚性差異不顯著，因此咀嚼性與硬度呈正相關。純菌種發(fā)酵改性的糯玉米粉熟面團的膠著性和咀嚼性顯著（P＜0.05）高于未發(fā)酵及自然發(fā)酵。乳酸菌對糯玉米粉起到改性作用可能是因為糯玉米淀粉中含有利于乳酸菌生長代謝的營養(yǎng)物質，乳酸菌代謝產生的二氧化碳增多致使糯玉米粉熟面團彈性和回復性的增加[31]，人工添加的乳酸菌含量要比自然發(fā)酵產生的乳酸菌含量多，因此改性效果優(yōu)于自然發(fā)酵。

2.5 未發(fā)酵、自然發(fā)酵、純種發(fā)酵掃描電子顯微鏡結果分析

圖6 發(fā)酵前后掃描電子顯微鏡圖片（×5 000）Fig. 6 Scanning electron microscope pictures of waxy corn flour before and after fermentation (× 5 000)

由圖6可見，發(fā)酵前后糯玉米粉的微觀結構發(fā)生了變化。原糯玉米粉微觀結構較為完整，自然發(fā)酵對糯玉米粉的侵蝕效果較輕，而純菌種發(fā)酵對其結構的破壞程度較自然發(fā)酵要更加明顯。自然發(fā)酵和純種發(fā)酵過程中乳酸菌利用了糯玉米粉里淀粉、蛋白質及脂肪等物質，生長代謝過程中產酸產酶影響其分子結構對糯玉米粉起到了改性的作用。

3 結 論

本研究采用MiSeq技術對自然發(fā)酵菌液中細菌

16S rDNA的V3～V4區(qū)進行測序分析，分析結果顯示自然發(fā)酵糯玉米碴中的細菌以乳桿菌屬為主，占65.14%，與其他人研究相符。通過稀釋涂布平板篩選出1株產酸能力最快、繁殖能力最佳的菌株進行鑒定，經測序比對鑒定其為發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum），同時符合細菌多樣性分析結果。通過對糊化特性和質構特性的測定，結果證明純種發(fā)酵會顯著提高峰值黏度、谷值黏度和最終黏度，顯著降低回生值；蒸制前后對比顯著增加硬度、黏附性、膠著性和咀嚼性從而改善糯玉米粉的粉質特性。為制作一種以發(fā)酵糯玉米粉為主要原料的食品且能夠縮短自然發(fā)酵周期的發(fā)酵劑提供理論依據。此研究僅證明了乳酸菌發(fā)酵對糯玉米粉及糯玉米熟面團的改性作用，而對自然發(fā)酵過程中酵母菌對其加工特性的影響、以及發(fā)酵后糯玉米的熟面團進一步應用還有待研究。