丙基化衍生-吹掃捕集-原子熒光光譜法同時(shí)測定動物源食品中的甲基汞和乙基汞

鄒學(xué)權(quán)，張文華，陳 孜

（浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 311215）

汞是典型的有毒元素，是全球性的重要污染物之一，在微生物的作用下，環(huán)境中的無機(jī)汞會轉(zhuǎn)化成毒性更強(qiáng)的有機(jī)汞，有機(jī)汞主要以甲基汞和乙基汞的形態(tài)存在。在所有的汞形態(tài)中，甲基汞的毒性最強(qiáng)，人體血液中甲基汞的含量若超過0.2 μg/g時(shí)就會出現(xiàn)明顯中毒癥狀。有機(jī)汞作為一種親脂性高毒物，進(jìn)入人體以后，主要是侵入神經(jīng)系統(tǒng)尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而對人體造成不可逆轉(zhuǎn)的損害。由汞及有機(jī)汞造成的環(huán)境和食品污染問題，已經(jīng)成為危害人類生存的重要公害之一。

目前測定汞形態(tài)的方法很多，最早的方法研究熱點(diǎn)主要為氣相色譜法[1-2]，常用的有苯萃取-氣相色譜電子捕獲法[3]、巰基棉富集氣相色譜法[4]等，何濱[5]、劉毅剛[6]等采用氣相色譜與原子吸收光譜法串聯(lián)的辦法測定農(nóng)田土壤中的甲基汞和乙基汞，方法的靈敏度和精密度相對偏低，選擇性差，前處理過程繁瑣，操作比較困難，很難準(zhǔn)確快速地對甲基汞和乙基汞進(jìn)行檢測。宋志峰[7]、王征[8]及福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 35/T 895-2009[9]等采用HPLC-ICP-MS法測定環(huán)境樣品中的甲基汞和乙基汞，該方法對甲基汞和乙基汞進(jìn)行檢測具有檢出限低、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，但由于該法所用儀器價(jià)格昂貴，也限制了該法的大范圍普及應(yīng)用。原子熒光光譜法是檢測汞的常用方法，采用高效液相色譜串聯(lián)原子熒光光度計(jì)法可以實(shí)現(xiàn)形態(tài)汞的分離與檢測，針對這一檢測方法的研究已有大量報(bào)道[10-13]，最早的國標(biāo)中即采用原子熒光法對無機(jī)汞進(jìn)行檢測，最新的國標(biāo)GB 5007.17-2014[14]中又加入了采用LC-AFS聯(lián)用的方法檢測食品中甲基汞的內(nèi)容，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3034-2011[15]中實(shí)現(xiàn)了LC-AFS法對水產(chǎn)品中無機(jī)汞、甲基汞和乙基汞的同時(shí)測定，測定低限可達(dá)0.05 mg/kg。

本研究建立動物源食品中同時(shí)測定無機(jī)汞、甲基汞和乙基汞的AFS測定方法，方法靈敏度高、檢測限低，檢測設(shè)備簡單易得、成本適中。采用丙基化衍生，通過吹掃捕集-氣相色譜分離-原子熒光光譜法進(jìn)行測定，由于吹掃捕集過程均在線完成，可大大提高方法的回收率與檢測結(jié)果的精密度。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：鹽酸，優(yōu)級純，Sigma公司；冰醋酸，優(yōu)級純，華東醫(yī)藥股份有限公司；氫氧化鉀，分析純，華東醫(yī)藥股份有限公司；甲醇，色譜純，華東醫(yī)藥股份有限公司；乙酸鈉，優(yōu)級純，華東醫(yī)藥股份有限公司；四丙基硼化鈉，優(yōu)級純，華東醫(yī)藥股份有限公司；高純氬氣，純度≥99.999%；高純氮?dú)?，純度?9.999%。

儀器：分析天平，感量0.0001 g和0.001 g，瑞士Mettler-Toledo公司；超純水凈化系統(tǒng)，美國millipore公司；渦旋混勻器，太倉市科教器材廠；酸度計(jì)，瑞士Mettler-Toledo公司；Deena II樣品全自動消解前處理系統(tǒng)；移液槍，Eppendorf。

1.2 檢測裝置圖

本文實(shí)驗(yàn)中所用的檢測裝置見圖1。

圖1 檢測裝置圖Fig 1 The diagram of detection device

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液液配制

1.3.1 丙基化試劑

在200 mL的干凈采樣瓶中加入110 mL的超純水和10 mL的甲醇，將稱好后的2 g氫氧化鉀加入瓶中溶解后放入冰箱（≤4℃）冷藏冰涼6～8 h后備用；將1 g冷凍保存的四丙基硼化鈉取出，迅速加入配制好的KOH甲醇溶液，溶解定容在另一個(gè)200 mL采樣瓶中用瓶塞塞緊。用移液器分別移取600 μL配制好的試劑加入到每個(gè)2 mL的離心管迅速壓緊蓋子，冷凍保存待用，保存期一個(gè)月。

1.3.2 緩沖溶液

稱取16.2 g的優(yōu)級純醋酸鈉（無水乙酸鈉）加入11.8 mL優(yōu)級純冰醋酸，用超純水定容至100 mL搖勻，待完全溶解后加入50 μL的丙基化試劑搖勻，以400 mL/min的速度用無汞氮?dú)獬?～8 h，蓋緊瓶蓋。

1.3.3 甲基汞、乙基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

甲基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW 08675，76.6 μg/g）；乙基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）081524，75.3 μg/g），國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.3.4 甲基汞、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液

分別移取0.6527 g甲基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與0.6640 g乙基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（見2.1.1.11），用甲醇稀釋定量至50 g,此儲備液中甲基汞與乙基汞的濃度均為1.0 μg/g，冰箱冷藏可保質(zhì)一個(gè)月。

1.3.5 甲基汞、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)使用液

在進(jìn)樣瓶中依次加 10 mL水、150 μL冰醋酸、60 μL 鹽酸、300 μL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（2.1.1.12），以水定量稱重至30 g,該使用液濃度為10 ng/g；按此方法取10 ng/g使用液稀釋成1 ng/g、0.01 ng/g使用液。

1.3.6 甲基汞、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)曲線系列

取50 μL 0.01 ng/g使用液至樣品瓶中，該瓶中含有的甲基汞、乙基汞含量為0.5 pg；依此方法配制 1 pg、2 pg、10 pg、50 pg、250 pg、1000 pg 的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列。

1.4 測定

準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品，加入2 mL 25%KOH甲醇溶液，在DEENA自動消解儀上于60℃下加熱4 h，間歇振動，消解完成后加去離子水8 mL定容渦旋混勻。取0.5 mL消解液于進(jìn)樣瓶中，加0.3 mL緩沖液，50 μL丙基化試劑，用去離子水加滿進(jìn)樣瓶，蓋緊瓶塞，上機(jī)測試。

儀器提前24 h預(yù)熱，待儀器自檢通過運(yùn)行正常后編輯儀器方法和測定序列，測定已配制好的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液系列、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量與響應(yīng)值的對應(yīng)關(guān)系得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品檢測的響應(yīng)值對樣品進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生劑及用量選擇

在樣品測試前處理進(jìn)行樣品衍生化反應(yīng)可提高甲基汞和乙基汞的揮發(fā)性，便于吹掃捕集系統(tǒng)將待測物質(zhì)吹掃出來，同時(shí)也便于甲基汞與乙基汞的分離。目前常用的測定有機(jī)汞的衍生試劑主要有乙基化試劑（四乙基硼化鈉）、四丙基硼化鈉等，由于四乙基硼化鈉作為衍生劑時(shí)，乙基汞和汞離子均可能生成了乙基汞化合物，難以區(qū)分乙基汞和二價(jià)汞，因而本研究采用四丙基硼化鈉作為衍生試劑。

丙基化試劑的加入屬于過量反應(yīng)，本研究考察了丙基化試劑用量分別為 20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、70 μL 對回收率的影響， 隨丙基化試劑用量的增加，回收率有增加的趨勢，在用量為40 μL的時(shí)候回收率即達(dá)到峰值，過多地加入對回收率的增加影響不大,說明丙基化試劑用量在40 μL時(shí)基本可以保證反應(yīng)完全,為確保高濃度的甲基汞和乙基汞能被完全衍生且節(jié)省衍生化試劑的用量,本研究采用50 μL的丙基化試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線譜圖及檢出限

標(biāo)準(zhǔn)空白溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液系列點(diǎn)在設(shè)定的儀器條件下測定,以系列點(diǎn)的質(zhì)量值為橫坐標(biāo)（X）,以峰高相應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y），儀器自動繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線譜圖，借助軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)譜圖及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖2～圖4所示，出峰順序分別為元素汞（Hg0）、甲基丙基汞、乙基丙基汞、二丙基汞,各目標(biāo)峰能完全分離、峰形對稱，相互之間無干擾。甲基汞與乙基汞的工作曲線線性關(guān)系均良好,其中甲基汞的線性方程為：y=460.89417x+584.50187，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999；乙基汞的線性方程為：y=172.87404+20.13597,線性相關(guān)系數(shù)為1。對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級稀釋，取信噪比為3時(shí)的標(biāo)液中污染物的質(zhì)量濃度定義為儀器檢出限，經(jīng)檢測，本方法甲基汞的檢出限為0.0010 ng/L、乙基汞的檢出限為0.0015 ng/L。

2.3 方法的精密度與回收率

圖2 甲基汞與乙基汞的標(biāo)準(zhǔn)譜圖Fig 2 Spectra of Methyl mercury and Ethyl mercury

圖3 甲基汞的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig 3 Calibration curve for the detection of Methyl mercury

圖4 乙基汞的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig 4 Calibration curve for the detection of Ethyl mercury

因汞在自然界的廣泛存在，空白樣品極其難找，因此在做方法精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)時(shí)采用純水作為空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為 25 pg、50 pg、100 pg，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù) 6 次試驗(yàn)，以回收率為考察指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，使用本文建立的方法是可以得到較高的加標(biāo)回收率，回收率范圍為88.6%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于10%，說明該法重復(fù)性好，精密度較高。

表1 回收率與精密度的試驗(yàn)結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品分析

采用本方法對動物源食品基質(zhì)中的甲基汞與乙基汞含量進(jìn)行分析，因現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)僅有魚肉中甲基汞含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無乙基汞的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因而乙基汞的測定采用加標(biāo)的方式進(jìn)行。選用國家標(biāo)物中心的GBW 10029魚肉中總汞與甲基汞成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加乙基汞的量為0.29 mg/kg，檢測結(jié)果見表2。由表2數(shù)據(jù)可知，本法測定值與認(rèn)定值及加標(biāo)值基本吻合，與國標(biāo)方法測定值基本一致。

表2 不同方法測定標(biāo)準(zhǔn)樣品中甲基汞與乙基汞含量的結(jié)果Tab 2 Analytical results of Methyl mercury and Ethyl mercury in certified reference materials with different method

3 結(jié)論

本研究建立了動物源食品中甲基汞與乙基汞的檢測方法，結(jié)果表明，該法前處理簡單、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好、檢測限低，回收率和精密度均能較好地滿足檢測分析的要求，采用本方法對質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測時(shí)測定值與認(rèn)定值吻合較好，與國標(biāo)法測定值基本一致，因而本法適用于動物源食品中甲基汞與乙基汞的檢測定值。