核酸適配體在胰腺癌中的應(yīng)用研究進(jìn)展

韓冬梅,鄧堂剛,葉 茂

(湖南大學(xué)生物學(xué)院,中國湖南長沙410082)

胰腺位于腹后壁,主要功能是消化糖、脂肪和蛋白質(zhì),體積雖小,卻是人體最重要的器官之一。胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,因其早期癥狀不明顯不易察覺,目前沒有很好的診斷指標(biāo),早期診斷非常困難。近年來,核酸適配體(aptamer,Apt)因其良好的特性成為研究熱點(diǎn),并已篩選出多個(gè)識(shí)別胰腺癌的核酸適配體,有望實(shí)現(xiàn)胰腺癌的早期診斷和靶向治療。本文對核酸適配體在胰腺癌中的應(yīng)用做一總結(jié)。

1PAC的現(xiàn)狀

PAC是一種較為常見的消化系統(tǒng)腫瘤,惡性程度和死亡率極高,且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。在西方國家,PAC死亡率逐漸升高,預(yù)計(jì)到2030年,將超過乳腺癌、前列腺癌和直腸癌,成為繼肺癌之后的第二大癌癥[1]。據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)估計(jì),2017年約有53 670人(27 970名男性和25 700名女性)患PAC,僅美國就有約43 090人(22 300名男性和20 790名女性)死于該病(http：//www.cancer.org/cancer/pancreatic-cancer/about/key-statistics.html,accessed on October 1,2017)。據(jù)流行病學(xué)和最終結(jié)果(The Surveillance,Epidemiology,and End Results,SEER)數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì),PAC患者的五年存活率僅為8.2%(2013-2017年),是所有實(shí)體瘤中死亡率最高的癌癥(https：//seer.cancer.gov/statfacts/html/pancreas.html,accessed on October 1,2017)。盡管數(shù)十年來,癌癥的診斷技術(shù)發(fā)展迅速,在外科手術(shù)和化療方面取得重要進(jìn)步,但是PAC患者預(yù)后仍然極差[2]。研究表明,PAC從癌前病變到浸潤這個(gè)過程中,基因突變數(shù)目不斷增加[3]。幾乎所有的胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinomas,PDAC)確診患者都攜帶有4種已知頻繁突變的驅(qū)動(dòng)基因(癌基因K-RAS和抑癌基因CDKN2A、TP53、SMAD4/DPC4)中的一種或幾種[3]。PAC病變早期幾乎沒有明顯癥狀,所以缺乏有效的早期診斷方法,一經(jīng)發(fā)現(xiàn)確診基本上為PAC晚期,且大多數(shù)的PDAC患者對化療藥物不敏感,缺乏有效的治療藥物[4]。即使有15%～20%的PAC患者經(jīng)過手術(shù)可將腫瘤切除,但大多數(shù)患者在一年內(nèi)會(huì)復(fù)發(fā)[4]。因此,開發(fā)新的有效的PAC診斷和治療方法具有重要意義。

2 核酸適配體

核酸適配體是通過SELEX技術(shù)得到的一種可以高特異性、高親和性識(shí)別靶標(biāo)物質(zhì)的單鏈DNA或RNA,可以作為靶向性治療的分子探針[5]。1990年,Tuerk和Gold[6]首次從體外隨機(jī)RNA文庫中篩選出對T4 DNA聚合酶具有結(jié)合親和力的兩個(gè)RNA序列,并創(chuàng)建了指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化的技術(shù)方法。與此同時(shí),Ellington和Szostak[7]從1010個(gè)隨機(jī)序列RNA分子的大文庫中分離出可以特異性結(jié)合多種有機(jī)染料的RNA,并創(chuàng)造了術(shù)語“aptamer”,同時(shí)將篩選到核酸適配體的過程命名為“SELEX”。SELEX程序通常包括：1)隨機(jī)單鏈DNA或RNA文庫設(shè)計(jì)和合成;2)對照篩選(負(fù)篩選);3)靶分子篩選(正篩選);4)洗脫;5)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增;6)制備單鏈寡核苷酸文庫;7)多輪篩選;8)克隆和測序;9)核酸適配體識(shí)別(圖1)[8]。DNA和RNA適配體的篩選存在一些差異。獲得DNA適配體,可通過常規(guī)PCR進(jìn)行結(jié)合序列的擴(kuò)增,隨后進(jìn)行單鏈DNA制備以產(chǎn)生次級(jí)文庫;若篩選對象為RNA,則需先反轉(zhuǎn)錄為DNA,然后擴(kuò)增成為雙鏈DNA(double stranded DNA,dsDNA)并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄然后進(jìn)行下一輪篩選。在SELEX過程中,一般通過8～20輪篩選富集,就能得到與靶分子高親和的核苷酸文庫,最后進(jìn)化后的文庫經(jīng)高通量測序和挑選鑒定,即可得到最終的一條核苷酸序列。SELEX篩選技術(shù)發(fā)展迅速,針對篩選的靶標(biāo)不同,有蛋白質(zhì) SELEX[9]、cell-SELEX[10]、親和層析 SELEX[11]、組織切片 SELEX[12]、MSD-SELEX[13]、活體SELEX[14],其中以cell-SELEX最為經(jīng)典。

核酸適配體通過形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)如發(fā)夾、環(huán)形、凸起、G4聚體等來識(shí)別不同的靶標(biāo)分子[15]。相比于單克隆抗體,核酸適配體除了具有高特異性、高親和性、穩(wěn)定性和無免疫源性等特點(diǎn),還有相對分子質(zhì)量小、易進(jìn)行化學(xué)修飾、生產(chǎn)成本低、識(shí)別范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。由于核酸適配體具有以上多種優(yōu)點(diǎn),在過去的數(shù)十年中,將其與多種納米材料相偶聯(lián),被廣泛應(yīng)用在生物學(xué)檢測[16]、分子診斷[17]、生物成像[18]、腫瘤分子分類[19]、藥物靶向[20,21]等領(lǐng)域。

圖1 核酸適配體的篩選進(jìn)程模式圖[8]Fig.1 Schematic of the aptamer selection[8]

3 核酸適配體在PAC中的應(yīng)用

近年來,核酸適配體和核酸適配體-納米材料偶聯(lián)體在癌癥檢測和治療中的應(yīng)用已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注。靶向PAC的適配體在細(xì)胞、組織和動(dòng)物水平的研究中已取得重大進(jìn)展。篩選出的一系列靶向PAC的適配體(表1)[22～29],為PAC的診斷和靶向治療提供了一種新的策略。

3.1 與PAC蛋白質(zhì)相關(guān)的適配體

3.1.1 EGFR

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種單體跨膜蛋白質(zhì),其與配體表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)結(jié)合,引起受體二聚化,導(dǎo)致自體磷酸化,從而激活細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)傳導(dǎo)。EGFR家族包括4個(gè)不同的受體：EGFR/ErbB-1、HER2/ErbB-2、HER3/ErbB-3、HER4/ErbB-4。它們在多種組織中表達(dá),且過表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖,與多種癌癥的發(fā)展和惡化相關(guān)[30,31]。30%～89%的PDAC患者會(huì)過表達(dá)EGFR,且在癌細(xì)胞和組織中均為高表達(dá)[32～34]。多項(xiàng)研究表明,EGFR與PDAC腫瘤大小、臨床分期分級(jí)、高死亡率、預(yù)后不良[35～37]密切相關(guān)。利用EGFR抗體和小分子抑制劑可以有效抑制PAC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[38],因此,以EGFR為靶點(diǎn),為治療PAC提供了新的思路。

Li等[28]為了得到在體內(nèi)具有高穩(wěn)定性的適配體,設(shè)計(jì)合成了2′-氟修飾的核酸酶抗性隨機(jī)文庫,以純化的EGFR蛋白為靶標(biāo),通過SELEX技術(shù),經(jīng)過9輪篩選富集,最終得到1條特異性識(shí)別EGFR的核酸酶抗性RNA核酸適配體2′-氟E07。E07本身具有一定的生物學(xué)功能,與EGF競爭結(jié)合EGFR的胞外區(qū)域,阻斷受體自磷酸化,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

吉西他濱(Gemzar,Gem,dFdC)是核苷類似物,和阿糖胞苷類似,都是通過影響DNA復(fù)制來抑制細(xì)胞增殖。Gem單藥已被美國食品和藥品監(jiān)督管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)治療晚期和轉(zhuǎn)移性PAC以及輔助治療切除的PAC,是目前多種實(shí)體瘤治療效果最好的單藥化療藥物[39]。然而,由于其無特異性識(shí)別能力,因此無法將足夠的藥物運(yùn)送到癌細(xì)胞中,功效受到限制。靶向遞送Gem進(jìn)入癌細(xì)胞在將藥物功效最大化的同時(shí)也降低了對正常細(xì)胞的毒副作用。Ray等[27]開發(fā)了一種基于衍生物的合成策略,將E07與Gem相偶聯(lián)。首先使Gem通過化學(xué)磷酸化形成三磷酸腺苷類似物(dFdCTP),隨后聚合形成一條單鏈。E07 3′端延長后與Gem三磷酸化形成的單鏈通過堿基互補(bǔ)形成E07-dFdCTP聚合物。經(jīng)流式和共聚焦數(shù)據(jù)證明,聚合物具有與E07同等的識(shí)別能力和內(nèi)化效果,可特異性識(shí)別高表達(dá)EGFR的PAC細(xì)胞MiaPaCa-2,而不識(shí)別低表達(dá)EGFR的PAC細(xì)胞HPAF-2。聚合物進(jìn)入細(xì)胞后,隨著溶酶體pH下降,E07與dFdCTP雙鏈解開,藥物以單磷酸形式dFdCMP被釋放到細(xì)胞質(zhì)中,發(fā)揮功效,引起細(xì)胞死亡(圖2)。核酸適配體E07靶向EGFR,且易內(nèi)化,在PAC靶向治療中具有很大的應(yīng)用價(jià)值。將來可以將其應(yīng)用在組織活體實(shí)驗(yàn)中,觀察其在活體中的治療效果,從而進(jìn)一步推動(dòng)E07在PAC診斷和治療的臨床應(yīng)用。

圖2 E07-dFdCTP藥物靶向釋放模式圖[27]Fig.2 Model for the E07 mediated delivery of the dFd-CTP[27]

表1 靶向PAC的核酸適配體Table1 The aptamers for pancreatic cells

3.1.2 Nucleolin

核仁素(nucleolin)是一種重要的質(zhì)膜蛋白質(zhì),過表達(dá)于包括PAC在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞膜上及其細(xì)胞質(zhì)中[40],與DNA復(fù)制和核糖體組裝密切相關(guān)。核仁素在人PDAC過表達(dá),且可調(diào)控促癌因子VEGF和Ang-2水平上調(diào),與PDAC轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、致死率高、預(yù)后不佳相關(guān)[41]。研究表明抑制核仁素與抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的結(jié)合,導(dǎo)致Bcl-2 mRNA表達(dá)水平降低,進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[42]。核仁素拮抗劑N6L是一種多肽,在PDAC小鼠模型中可明顯抑制原發(fā)性腫瘤的生長和肝轉(zhuǎn)移,同時(shí)也可以抑制胰腺腫瘤的血管生成[41]。核仁素抑制劑的應(yīng)用是一種新的PAC治療策略,具有很好的臨床應(yīng)用前景。

AS1411是一種富含鳥嘌呤核苷酸的DNA適配體,可以特異性結(jié)合細(xì)胞表面的核仁素,導(dǎo)致復(fù)合物內(nèi)化。高劑量時(shí),AS1411與核仁素結(jié)合,通過抑制NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[43]。核酸適配體AS1411目前正處于復(fù)發(fā)或難治性急性髓系白血病(NCT00512083,NCT01034410)和腎細(xì)胞癌(NCT00740441)的 II期臨床試驗(yàn)中[44],未來有望用于PAC的臨床治療。

雷公藤內(nèi)酯(triptolide,TP)可抑制化療耐藥性PAC細(xì)胞系(chemo-resistant pancreatic cancer,CPC)的增殖,與Gem相比表現(xiàn)出更加優(yōu)越的抗癌效果。但是,TP沒有特異性,對正常細(xì)胞具有毒副作用。Wang等[45]成功實(shí)現(xiàn)了AS1411介導(dǎo)的納米聚合物載體靶向CPC細(xì)胞,并盡量避免了由TP對正常細(xì)胞造成的毒性。首先將AS1411適配體與羧基封端的聚乙二醇-丙交酯偶聯(lián)(HOOC-PEG-PDLLA),然后制備AS1411-PEG-PDLLA負(fù)載TP(ASPPT)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AS-PPT具有與AS1441同等的靶向能力,以及比TP更佳的抗腫瘤效果。此外,使用生物光子成像技術(shù)觀察AS-PPT(Cy3-labed TP)在組織和細(xì)胞水平上的分布,結(jié)果顯示AS1411促進(jìn)了TP在腫瘤組織和CPC細(xì)胞中的選擇性積累。進(jìn)一步構(gòu)建PAC小鼠模型,對小鼠給藥AS-PPT(實(shí)驗(yàn)組)和臨床抗癌藥Gemzar? (對照組),結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠生存周期更長。這項(xiàng)工作為攻克耐藥性PAC提供了一種新的策略。

除了EGFR和nucleolin之外,胎盤樣堿性磷酸酶2 (alkaline phosphatase placental-like 2,ALP PL2)、G蛋白偶聯(lián)的縮膽囊肽B受體(G-proteincoupled cholecystokinin B receptor,CCKBR)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor,TfR)等均被發(fā)現(xiàn)在PAC細(xì)胞高表達(dá)。Dua等[46]通過cell-SELEX技術(shù)篩選得到了靶標(biāo)為ALPPL2且具有核酸酶抗性的RNA適配體SQ2。Clawson等[24]得到了高親和力、靶標(biāo)為CCKBR的DNA適配體AP1153。這些核酸適配體有望提高PAC的早期診斷以及靶向治療效果。

3.2 與PAC細(xì)胞相關(guān)的適配體

為了增強(qiáng)適配體對PAC細(xì)胞的特異性,Wu等[25]直接以PDAC細(xì)胞系PL45為正篩靶細(xì)胞,胰腺正常細(xì)胞系hTERT-HPNE為負(fù)篩細(xì)胞,通過cell-SELEX技術(shù),15輪后得到信號(hào)富集,進(jìn)一步通過高通量測序和挑選最終成功得到一條可以特異性識(shí)別PL45的DNA適配體XQ-2,經(jīng)序列刪減得到XQ-2d。適配體對PL45細(xì)胞具有高親和力(Kd=55.02±0.4 nmol/L),靶標(biāo)蛋白質(zhì)初步確定為細(xì)胞表面的膜蛋白,小鼠體內(nèi)成像和臨床組織實(shí)驗(yàn)表明XQ-2d具有對PDAC診斷和分子成像的潛力,這可能有助于研究腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制。

Champanhac等[26]同樣以PL45為靶細(xì)胞,以胰腺正常細(xì)胞系TOV-21G為負(fù)篩細(xì)胞,得到8條可以識(shí)別PL45,而不識(shí)別TOV-21G的DNA適配體(PL1,PL2,PL3,PL4,PL5,PL6,PL7,PL8)。其中PL8在37℃具有更佳的內(nèi)吞效果和更好的親和性,可將其設(shè)計(jì)構(gòu)建納米系統(tǒng)進(jìn)行靶向治療研究。研究人員進(jìn)一步用PL8構(gòu)建納米系統(tǒng)的識(shí)別組分(將一端堿基延長形成Tr8t),隨后將其與部分互補(bǔ)的短DNA鏈(M1和M2)通過堿基互補(bǔ)配對自組裝雜交形成NT8。NT8富含GC堿基對以便嵌入更多的阿霉素(doxorubicin,DOX)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,一個(gè)NT8至少可以裝載50個(gè)阿霉素,大大增加了載藥量(圖3)。NT8靶向PL45,經(jīng)內(nèi)化將裝載的阿霉素釋放到細(xì)胞質(zhì)中,特異性增加PAC細(xì)胞中的藥物濃度,最終實(shí)現(xiàn)PAC的靶向治療。

4 核酸適配體應(yīng)用在PAC中面臨的問題及展望

圖3 NT8的形成及藥物裝載模式圖[26]Fig.3 Schematics of the self-assembly of aptamer-tethered DNA nanotrains(NT8)and drug loading[26]

近年來,PAC發(fā)病率呈逐年上升趨勢,已成為我國常見的十大惡性腫瘤之一[47]。核酸適配體的靶向特異性、高親和性、良好穩(wěn)定性、無免疫源性、易修飾、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢,使其成為PAC診斷與治療相關(guān)研究的熱點(diǎn)。核酸適配體易進(jìn)行化學(xué)修飾,利用其特異性識(shí)別能力,通過與納米材料、siRNA、CRISPR-Cas9等相偶聯(lián),可經(jīng)多種方式改善PAC的靶向治療效果。靶向PAC細(xì)胞的DNA適配體可以被開發(fā)成傳感器,用于快速、高效和更加靈敏地檢測PAC,有希望用于早期PAC診斷。此外,適配體可以用于構(gòu)建PAC的靶向藥物遞送系統(tǒng)。迄今為止,人們已經(jīng)開發(fā)了各種基于適配體的藥物運(yùn)送系統(tǒng),其中,因?yàn)檫m配體偶聯(lián)納米材料可以提高載藥量和控制藥物釋放效率成為研究熱點(diǎn)。在這些系統(tǒng)中,適配體作為特定的靶向識(shí)別配體,將納米材料裝載的大量藥物靶向運(yùn)送到癌細(xì)胞中,發(fā)揮藥物最大功效。然而,目前只有一種基于適配體的藥物Macugen被FDA批準(zhǔn)[48]。雖然有幾種適配體藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,但是臨床應(yīng)用尚沒有推廣開來,究其原因主要是：1)適配體在體內(nèi)穩(wěn)定性差,體外篩選得到的適配體很容易在血清中被核酸酶降解[49];2)適配體帶有負(fù)電荷,在體內(nèi)容易非特異性結(jié)合具有正電荷的分子或離子;3)適配體體積小,相對分子質(zhì)量小,易被腎臟快速過濾,且易非特異性積累在肝臟、脾臟等非靶器官,可能引起嚴(yán)重的免疫激活和聚陰離子效應(yīng),降低治療效果;4)盡管體外適配體的毒性較低,但其體內(nèi)毒性仍存在爭議,需要更詳細(xì)的研究。適配體的上述問題和挑戰(zhàn)大大限制了它們在PAC的臨床應(yīng)用。

核酸適配體的發(fā)展為腫瘤靶向治療提供了一種新的方法,在PAC的早期診斷和治療中有很好的應(yīng)用前景。為了推動(dòng)適配體在PAC臨床應(yīng)用的發(fā)展,主要可從以下幾個(gè)方面來解決上述問題：1)應(yīng)用高效SELEX技術(shù)篩選具有高特異性、親和力、生理穩(wěn)定性及體內(nèi)低副作用的適配體;2)為了改善適配體在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性,通常采用氟、氨基、甲氧基等基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾;3)作為野生型RNA適體(D-適配體)的鏡像異構(gòu)體(L-適配體)也已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于PAC治療中,它們具有極好的體內(nèi)核酸酶降解抗性[50,51];4)多功能納米材料具有諸如單分散性、良好的生物相容性、低毒性、高包封率、藥物可控釋放等優(yōu)點(diǎn),將核酸適配體構(gòu)建到納米系統(tǒng),可以設(shè)計(jì)合成符合臨床應(yīng)用要求的新型納米材料;5)適配體的相對分子質(zhì)量通常在5～15 kD范圍內(nèi),雖然經(jīng)過化學(xué)修飾的適配體在體內(nèi)對核酸酶降解具有良好的抗性,但是易被腎代謝。偶聯(lián)納米材料增加適配體的相對分子質(zhì)量可以很好地解決此問題。因此,應(yīng)開發(fā)更多的適配體納米材料偶聯(lián)物來降低腎臟過濾量,從而提高適配體在PAC患者體內(nèi)的濃度,改善治療效果。