幾種腫瘤生物標(biāo)志物研究方法及結(jié)果的比較

王 婷,高友鶴

(北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó)北京100875)

生物標(biāo)志物是指與生理或者病理生理過(guò)程相聯(lián)系的可監(jiān)測(cè)的變化[1],研究者們從動(dòng)物模型或人的血液、尿液、器官灌流液、細(xì)胞培養(yǎng)液等各處尋找這種變化作為生物標(biāo)志物。本文主要論述從腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基、腫瘤動(dòng)物模型的器官灌流液、尿液中利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選差異蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物的優(yōu)缺點(diǎn),為之后的實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)。

尿液作為生物標(biāo)志物更為早期敏感,因?yàn)闄C(jī)體內(nèi)環(huán)境受穩(wěn)態(tài)機(jī)制的調(diào)控,在疾病早期階段血液里所產(chǎn)生的各種細(xì)微變化會(huì)被迅速降解或者排除到體外,尿液作為機(jī)體的代謝廢物,能夠收集這些變化。尿液樣本還可以無(wú)創(chuàng)、連續(xù)、大量收集,受試者可以連續(xù)多次取樣,實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的動(dòng)態(tài)監(jiān)控。其次,相對(duì)于血液中白蛋白等高豐度蛋白質(zhì)的抑制作用,尿蛋白質(zhì)組組成更簡(jiǎn)單,背景低。對(duì)血液和尿液采取完全一樣的蛋白質(zhì)鑒定分析策略,尿液中可以鑒定到更多的蛋白質(zhì)[2]。另外,尿液中包含豐富的生物學(xué)信息,它能反映泌尿系統(tǒng)及其他系統(tǒng)的疾病,例如：腦部疾病、心臟疾病、代謝性疾病[3,4]。據(jù)Urinary Protein Biomarker Database(2017/06/29更新)所收錄的信息,有924個(gè)尿液候選蛋白質(zhì)標(biāo)志物被報(bào)道與159種病理生理狀態(tài)相關(guān)[5]。

我們實(shí)驗(yàn)室一直致力于對(duì)尿液樣本收集保存方法的開(kāi)發(fā),同時(shí)探究尿液是否能反映機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)的疾病狀態(tài)。對(duì)于尿液樣本的收集保存,實(shí)驗(yàn)室提出將尿液中的生物成分結(jié)合到膜上后干燥真空保存的方法[6,7]。但這種方法以及所用設(shè)備,適用于收集能自主排尿的人群的尿液樣本,方便由實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院等樣本集中場(chǎng)所的專(zhuān)業(yè)人員操作。為了適應(yīng)各種人群、方便在任何地方對(duì)尿液進(jìn)行便捷高效的收集和保存,實(shí)驗(yàn)室還提出了絨毛漿輔助收集尿液法[8]和注射器聯(lián)合濾器收集尿液法[9],前者方便了嬰幼兒尿液的收集,后者使居家環(huán)境收集保存尿液成為可能。

在實(shí)驗(yàn)室對(duì)尿液能否反映機(jī)體疾病狀態(tài)的研究中,我們發(fā)現(xiàn)它能反映眾多系統(tǒng)的疾病。在腎臟疾病方面：兩種不同的腎小球損傷,在腎臟組織病理學(xué)改變前,二者的尿蛋白質(zhì)已明顯變化[10];單側(cè)輸尿管結(jié)扎的腎臟間質(zhì)纖維化模型中,尿蛋白質(zhì)顯著變化[11];阿霉素誘導(dǎo)的局灶性節(jié)段性腎小球硬化模型中,尿蛋白質(zhì)隨疾病進(jìn)展連續(xù)變化[12]。在累及其他器官的疾病中,比如：由博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型[13]、實(shí)驗(yàn)性自身免疫心肌炎大鼠模型[14]、細(xì)菌性腦膜炎大鼠模型[15]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤大鼠模型[16]以及皮下種植Walker-256腫瘤大鼠模型[17],這些模型大鼠出現(xiàn)臨床癥狀或者其組織病理學(xué)改變前,尿蛋白質(zhì)組都已經(jīng)出現(xiàn)明顯變化。綜上所述,尿液可以早期、敏感地反映機(jī)體因疾病所產(chǎn)生的變化。

文中提及的腫瘤細(xì)胞系有：惡性轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞(SH-4,一種源自轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的胸腔積液的細(xì)胞系),人胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)細(xì)胞(GIST882),小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞肉瘤(dendritic cell sarcoma,DCS)細(xì)胞。對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道的黑色素瘤細(xì)胞系(SH-4)的差異蛋白質(zhì)[18],我們使用DAVID[19]生物信息學(xué)在線軟件分析其生物功能;人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞(GIST882)分泌蛋白質(zhì)的功能源自文獻(xiàn)[20]的結(jié)果;小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞肉瘤(DCS)細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)鑒定[21]是本實(shí)驗(yàn)室早期研究成果,本次分析我們使用DAVID[19]生物信息學(xué)在線軟件研究其生物功能。

對(duì)于大鼠腫瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移模型的研究,肝臟灌洗液的差異蛋白質(zhì)及功能直接來(lái)自文獻(xiàn)[22]的研究結(jié)論;大鼠皮下腫瘤尿液蛋白質(zhì)組差異蛋白質(zhì)及其功能也直接來(lái)自文獻(xiàn)[17]的結(jié)論。

1 細(xì)胞培養(yǎng)液

腫瘤研究中有很大一部分標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞系所分泌的蛋白質(zhì)。針對(duì)惡性轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞(SH-4)的研究結(jié)果[18],我們使用DAVID[19]生物信息學(xué)在線軟件對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)(詳細(xì)數(shù)據(jù)源自文獻(xiàn)[18]的Supplementary Table 5：Output of statistical analysis from paired fibroblasts(A375 and SH-4)showing differentially expressed proteins)進(jìn)行功能注釋,涉及的生物過(guò)程(表1)如下：硫酸角質(zhì)素分解代謝過(guò)程、糖鞘脂代謝過(guò)程、內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控、負(fù)調(diào)控凋亡過(guò)程、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、對(duì)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、細(xì)胞黏附、白細(xì)胞細(xì)胞黏附、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等。這些過(guò)程中與機(jī)體抵抗腫瘤相關(guān)的途徑少之又少,僅T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性這一途徑與免疫即機(jī)體防御相關(guān),且其中參與的蛋白質(zhì)只有2種。

另一關(guān)于人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞(GIST882)的研究[20]中,我們?cè)趯?duì)該細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)所鑒定到的375種蛋白質(zhì)中50.3%的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行DAVID功能注解后發(fā)現(xiàn),分泌蛋白質(zhì)參與的生物功能有：調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)、MAP激酶活性、免疫反應(yīng)、對(duì)傷害的發(fā)展和反應(yīng)、有機(jī)物質(zhì)、激素刺激、氧化應(yīng)激、內(nèi)外刺激等(詳細(xì)數(shù)據(jù)源自文獻(xiàn)[20]的Table 4：Functional clustering of all GIST882 secretory proteins found in un-stimulated samples)。同樣,在這些生物過(guò)程中與機(jī)體防御相關(guān)的機(jī)制極少,僅有的與防御相關(guān)的免疫反應(yīng)這一途徑中,只有12種蛋白質(zhì)參與其中。

在實(shí)驗(yàn)室早期研究中,我們使用質(zhì)譜對(duì)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞肉瘤(DCS)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行了分析,鑒定到72種分泌蛋白質(zhì)(非差異蛋白質(zhì))[21](詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)文獻(xiàn)[21]的 Table 2：Secretory proteins of mouse dendritic cell sarcoma cell line were identified by SCX-RP-MS/MS)。對(duì)72個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行DAVID功能注解,發(fā)現(xiàn)涉及的生物功能(表2)有：糖酵解、各種糖類(lèi)分解代謝過(guò)程、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、細(xì)胞黏附、免疫反應(yīng)等,其中免疫反應(yīng)與機(jī)體防御機(jī)制相關(guān),僅有6種蛋白質(zhì)參與其中。

表1 使用DAVID對(duì)人惡性轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞(SH-4)培養(yǎng)液篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注解Table1 Functional clustering of metastatic melanoma cell line(SH-4)differentially expressed proteins

從上述對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基分泌蛋白質(zhì)的研究可以看出,這些分泌蛋白質(zhì)或差異蛋白質(zhì)極少參與機(jī)體防御機(jī)制相關(guān)的反應(yīng),而且在這些極個(gè)別的反應(yīng)中僅有為數(shù)不多的蛋白質(zhì)參與其中。即使這些反應(yīng)與機(jī)體抵御腫瘤相關(guān),理論上也不能作為參考,因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)是在體外發(fā)現(xiàn)變化的系統(tǒng),細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境不同于在體內(nèi)的情況,差異可能是由外界環(huán)境刺激造成。此外,由于培養(yǎng)條件較復(fù)雜,稍微不適則可能造成蛋白質(zhì)的改變或者細(xì)胞的死亡,不能體現(xiàn)機(jī)體對(duì)腫瘤的防御反應(yīng)。可見(jiàn),從腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液中篩選差異蛋白質(zhì)作為標(biāo)志物的方法,并不是很好的尋找生物標(biāo)志物的方式。

2 器官灌流液

在實(shí)驗(yàn)室前期研究中,我們將Walker-256腫瘤細(xì)胞接種到雄性SD大鼠脾臟中使其發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,并從模型的肝臟灌流液中鑒定出86種差異蛋白質(zhì)[22],其中27種屬于分泌蛋白質(zhì),59種為非分泌蛋白質(zhì)(詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)文獻(xiàn)[22]的Additional file 2：Table S3：Lists all the differential proteins identified in perfusates)。分泌蛋白質(zhì)與非分泌蛋白質(zhì)分別用 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)工具[23](http：//www.ingenuity.com/,Ingenuity Systems,Redwood City,CA,USA)進(jìn)行功能分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有5種分泌蛋白質(zhì)：甲狀腺素(transthyretin,TTR)、甘露糖結(jié)合蛋白 C(mannose-binding protein C,MBL2)、纖維連接蛋白亞型1/2(isoform 1/2 of fibronectin,FN1)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)和alpha-2抗血纖維蛋白溶酶(alpha-2 antiplasmin,serpinf1)參與了急性期反應(yīng)這一通路(圖1A)。急性期反應(yīng)是一種在免疫防御中起著重要作用的肝功能。在前述灌流液中這些蛋白質(zhì)大部分呈降低的趨勢(shì)(詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)文獻(xiàn)[22]的 Additional file 2：Table S3：Lists all the differential proteins identified in perfusates),這表明與肝臟相關(guān)的免疫功能被轉(zhuǎn)移或被腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)損害。而其他59種非分泌蛋白質(zhì)參與的主要是肝臟增生/過(guò)度增殖、肝炎、脂肪肝、肝臟脂肪變性和肝細(xì)胞癌(圖1B),與癌癥及轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表2 使用DAVID對(duì)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞肉瘤(DCS)細(xì)胞培養(yǎng)液的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注解的結(jié)果Table2 Functional clustering of mouse dendritic cell sarcoma cell line differentially expressed proteins

但是灌流條件并不能完全模仿真實(shí)的體內(nèi)條件,并可能引起因壓力或缺血造成的相關(guān)損傷,從而影響灌流液中某些蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度。因此,在灌流液中被鑒定為差異表達(dá)的一些蛋白質(zhì)可能是由灌流而不是由疾病引起的變化,應(yīng)該通過(guò)在血漿或血清中的進(jìn)一步驗(yàn)證來(lái)排除這種假陽(yáng)性標(biāo)識(shí)。上面提到參與急性期反應(yīng)的蛋白質(zhì)可能就是器官在灌流過(guò)程中所產(chǎn)生的變化。并且,由上述結(jié)果可以看出在器官灌流液中參與機(jī)體防御機(jī)制的蛋白質(zhì)很少,且是否是宿主或器官因腫瘤而不是因外界干擾(灌流)所產(chǎn)生的變化也有待確認(rèn),因?yàn)樵诠嗔髦袡C(jī)體所產(chǎn)生抗體已被洗去。此外,在構(gòu)建動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,還需要對(duì)器官進(jìn)行灌流,操作困難,取樣麻煩,樣品易受到外界環(huán)境的刺激而不能真實(shí)反映宿主因腫瘤所產(chǎn)生的變化。基于以上分析認(rèn)為,在器官灌流液中尋找生物標(biāo)志物并不是很好的方式。

3 尿液蛋白質(zhì)組

我們?cè)谇捌谘芯恐惺褂肳alker-256細(xì)胞構(gòu)建了大鼠皮下腫瘤模型[17],并在該模型大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)了127種差異蛋白質(zhì)(詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)文獻(xiàn)[17]的Supporting information Table S2：Differential proteins at different tumor stages)。使用DAVID進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的功能注釋,發(fā)現(xiàn)在生物過(guò)程類(lèi)別中,急性期反應(yīng)和先天性免疫反應(yīng)在所有時(shí)間點(diǎn)都是過(guò)度表達(dá)的;補(bǔ)體激活、內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)、衰老和炎癥反應(yīng)在第6、9和14 d被過(guò)度表達(dá);而腫瘤壞死因子產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控在第9 d和第14 d過(guò)度表達(dá)(圖2A)。使用IPA進(jìn)行典型途徑富集分析,發(fā)現(xiàn)在腫瘤進(jìn)展期間以下途徑顯著富集：LXR/RXR活化、急性期反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)、巨噬細(xì)胞中IL-12信號(hào)傳導(dǎo)和產(chǎn)生、巨噬細(xì)胞中一氧化氮和活性氧的產(chǎn)生、網(wǎng)格蛋白藥物內(nèi)吞信號(hào)傳導(dǎo)和補(bǔ)體系統(tǒng)(圖2D)。

以上差異蛋白質(zhì)所參與的生物過(guò)程以及經(jīng)典途徑大多與免疫相關(guān),且在腫瘤發(fā)展過(guò)程中一直存在,說(shuō)明這些差異蛋白質(zhì)可以反映宿主在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中所產(chǎn)生的變化,且大部分是機(jī)體防御所造成的變化。采用這種方法篩選差異蛋白質(zhì),其優(yōu)點(diǎn)還有：取樣簡(jiǎn)單,樣品只反映宿主狀態(tài)而不受其他條件刺激,并且可以伴隨疾病進(jìn)展隨時(shí)取樣。

圖1 Walker-256腫瘤細(xì)胞大鼠肝轉(zhuǎn)移模型的肝臟灌流液中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分析Fig.1 Functional analysis of the differentially expressed proteins in perfusates

圖2 Walker-256腫瘤細(xì)胞皮下荷瘤大鼠模型腫瘤發(fā)展過(guò)程中尿液差異蛋白質(zhì)的功能分析Fig.2 Functional analysis of differential proteins during cancer development

在我們實(shí)驗(yàn)室其他初步結(jié)果中也發(fā)現(xiàn),使用荷瘤大鼠模型尿液蛋白質(zhì)組所尋找的差異蛋白質(zhì)可以很好地體現(xiàn)宿主對(duì)腫瘤的反應(yīng),而且眾多蛋白質(zhì)參與其中。例如：在大鼠腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型中發(fā)現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)參與了這些途徑：急性期反應(yīng)、白細(xì)胞細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)過(guò)程、補(bǔ)體激活,經(jīng)典途徑、炎癥反應(yīng)、吞噬,識(shí)別、先天性免疫反應(yīng)等過(guò)程;大鼠腫瘤細(xì)胞骨種植瘤模型的差異蛋白質(zhì)參與了：急性期反應(yīng)、先天性免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、抗菌體液應(yīng)答、補(bǔ)體激活的負(fù)調(diào)控,凝集素途徑、正向調(diào)節(jié)吞噬作用、負(fù)性調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等過(guò)程。由此可以看出,當(dāng)監(jiān)測(cè)到腫瘤產(chǎn)生的非正常狀態(tài)或者外來(lái)異物時(shí),機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一系列的防御與抵抗(包括免疫),而這些反應(yīng)應(yīng)該可以更好地反映疾病早期機(jī)體所產(chǎn)生的變化,是生物標(biāo)志物更為理想的來(lái)源。

4 小結(jié)與展望

綜上所述,在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基的差異蛋白質(zhì)以及全蛋白質(zhì)中,參與機(jī)體防御相關(guān)反應(yīng)(例如免疫)的蛋白質(zhì)極少,且理論上不能體現(xiàn)機(jī)體反應(yīng),只能反映細(xì)胞在體外培養(yǎng)下的情況。荷瘤大鼠器官灌流液中篩選出的差異蛋白質(zhì)同樣極少參與機(jī)體防御,而且很大程度上受到灌流的刺激。雖然細(xì)胞所處的環(huán)境比培養(yǎng)基更像生理狀態(tài),但又不同于機(jī)體本身的狀態(tài)。而從荷瘤大鼠尿液中尋找的差異蛋白質(zhì)則完全不同,可以看到許多與機(jī)體防御息息相關(guān)的生物過(guò)程,并且伴隨著腫瘤的進(jìn)展,眾多蛋白質(zhì)參與其中。而免疫等機(jī)體防御疾病做出的反應(yīng),會(huì)在疾病早期發(fā)生并產(chǎn)生變化,而這些變化正是早期標(biāo)志物的理想來(lái)源,所以三者中荷瘤大鼠的尿液是生物標(biāo)志物更好的來(lái)源。

從方法上來(lái)說(shuō),利用大鼠疾病模型尿液尋找生物標(biāo)志物要優(yōu)于利用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液、荷瘤器官灌流液尋找生物標(biāo)志物：1)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中篩選差異蛋白質(zhì)作為標(biāo)志物,不能反映細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的狀況,差異可能由環(huán)境刺激所引發(fā),對(duì)培養(yǎng)條件的要求較高,稍有變化就可能造成蛋白質(zhì)的改變或者細(xì)胞的死亡;2)器官灌流操作較困難,灌流時(shí)不可以使用血液,還需排除血清或血漿的污染,且灌流會(huì)對(duì)器官造成損傷并引起一些蛋白質(zhì)的變化。此外,器官已取出體外,不能全面客觀地反映宿主因疾病所產(chǎn)生的變化;3)尿液則不同,收取樣本簡(jiǎn)單方便,宿主幾乎沒(méi)有受到外界干擾,且伴隨腫瘤進(jìn)展隨時(shí)取樣,差異蛋白質(zhì)可以全面反映宿主因腫瘤所產(chǎn)生的變化。而且,在早期診斷中宿主對(duì)腫瘤所產(chǎn)生的變化(包括免疫)是至關(guān)重要的一部分,理論上早期可能正是宿主的免疫在與腫瘤作斗爭(zhēng)的階段,所產(chǎn)生的變化對(duì)早期診斷就顯得很重要,是極其重要的生物標(biāo)志物來(lái)源?？偟膩?lái)講,我們認(rèn)為從大鼠模型尿液中尋找標(biāo)志物的方法是更為合適的,得到的結(jié)果也更為合理和嚴(yán)謹(jǐn)。