兩種試劑盒提取大鼠容受期少量宮腔液胞外囊泡的比較

黃 曦,李艷萍*

(1.中南大學湘雅醫(yī)院生殖醫(yī)學中心,中國湖南長沙410008;2.湖南省女性生殖健康臨床研究中心,中國湖南長沙410008)

胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu),內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸分子、脂質(zhì)等豐富生物信息分子的納米級囊泡。按照形成的方式和顆粒大小,EVs大致分為三類[1]：外泌體(exosome)、微囊泡(microvesicle,MV)和凋亡小體(apoptotic body)。其中外泌體和微囊泡都被證實可以運載生物信息并在細胞間傳遞,從而參與調(diào)控生物過程[2,3],比如癌細胞的遷移侵襲[4]和機體的免疫反應(yīng)[5]。因此胞外囊泡具有極大的臨床應(yīng)用價值,除了將其自身的生物效能應(yīng)用于臨床治療[6],還可以開發(fā)為疾病液體活檢標志物[7]、靶向藥物的載體[8]等。EVs存在于幾乎所有的細胞培養(yǎng)上清和生物體液中。在生殖系統(tǒng)中,人們陸續(xù)在精液[9]、卵泡液[10]、輸卵管液[11]、胚胎培養(yǎng)液[12]、體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)液[13]以及本研究討論的宮腔液(uterine luminal fluid,ULF)中,都分離得到了EVs,且其中的內(nèi)容物比如蛋白質(zhì)、miRNA、脂質(zhì)分子等都表現(xiàn)出和源細胞一致的特異性改變。例如,在子宮內(nèi)膜不同時期(增殖期和分泌期),子宮內(nèi)膜上皮細胞來源的EVs內(nèi)容物也會出現(xiàn)相應(yīng)的變化[14]。

人類的整個生殖過程極其復(fù)雜,需要多方面的協(xié)調(diào)與同步。在輔助生殖治療過程中,一個發(fā)育良好的胚胎遇到的第一個關(guān)卡便是成功在母體子宮內(nèi)膜上皮種植。因此,宮腔液作為胚胎與內(nèi)膜接觸之前所處的微環(huán)境,對于妊娠的早期建立十分重要。宮腔液主要由子宮內(nèi)膜的分泌物、血漿滲出物和輸卵管液混合而成。在胚胎種植動物模型中,子宮內(nèi)膜可以通過離子通道的吸收和分泌作用調(diào)節(jié)宮腔液的水分子和離子成分,在容受期會形成宮腔液的“吸收峰”,從而調(diào)控胚胎種植[15]。2013年,Ng等[13]首次在人類宮腔液中分離得到EVs,并且發(fā)現(xiàn)宮腔液EVs與子宮內(nèi)膜上皮細胞分泌的EVs均表達細胞表面蛋白質(zhì)CD9和CD63,由此推論,宮腔液EVs可能大部分由子宮內(nèi)膜上皮細胞分泌的EVs組成,從而能夠?qū)崟r反映子宮內(nèi)膜的容受狀態(tài)。2015年,Vilella等[16]發(fā)現(xiàn),人類子宮內(nèi)膜上皮細胞中的miR-30d在容受期表達量增加,且該miRNA可以通過EVs的形式釋放到外環(huán)境,攜帶了miR-30d的EVs被老鼠胚胎的滋養(yǎng)細胞攝取后,間接激活I(lǐng)tgb3、Itga7和Cdh5,從而提高胚胎的黏附能力。

與常規(guī)研究的血清和細胞培養(yǎng)上清不同,子宮腔體積有限,可獲得的宮腔液樣本量往往較少,不能滿足EVs傳統(tǒng)梯度超速離心提取方法對樣本量的要求。因此,如何更高效地從少量宮腔液樣本中獲得高純度的EVs是首先要攻克的難題。隨著EVs的研究熱度逐年提升,商業(yè)化的提取試劑盒應(yīng)勢而生。PEG沉淀法具有操作方便、對樣本量和設(shè)備要求低的優(yōu)點,是目前廣泛使用的主流試劑盒之一,然而該法容易產(chǎn)生難以去除的聚合物,導(dǎo)致EVs的提取純度較低。親和膜離心柱法是近年來推出的年輕產(chǎn)品,提取效能與傳統(tǒng)離心方法接近。其利用囊泡通用生化特性進行分離,有效避免了額外的物質(zhì)污染。然而作為年輕產(chǎn)品,親和膜離心柱法被運用于提取少量體液樣本時是否存在缺陷尚未明確。在本文中,我們分別使用PEG沉淀法和親和膜離心柱法兩款試劑盒對同一份大鼠宮腔液EVs進行提取,從形態(tài)、表面特征蛋白質(zhì)和粒徑分布對EVs進行多維度鑒定比較,通過進一步分析比較內(nèi)含RNA的特性,最終優(yōu)選出針對少量樣本的EVs提取和后續(xù)EV miRNA機制研究的試劑盒。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

從中南大學動物實驗學部購入7周齡健康、性成熟、未孕的SPF級SD雌性大鼠36只,體質(zhì)量(237±1.7 g),SPF級成熟雄性SD大鼠30只,動物質(zhì)量合格許可證號：SCXK(湘)2016-0002。實驗動物寄養(yǎng)于中南大學動物實驗學部清潔屏障環(huán)境中,溫度24℃,相對濕度50%±5%,光照12 h,充分給水,普通飼料飼養(yǎng),自由攝食,每籠3～4只。新購入大鼠均飼養(yǎng)5～7 d適應(yīng)環(huán)境后用于實驗。實驗員具有實驗動物從業(yè)人員崗位證書,編號：7031號。

1.1.2 主要設(shè)備和試劑

水合氯醛(分析純,安徽酷爾生物工程有限公司),低溫超速離心機(Eppendorf 5424R,德國Eppen-dorf公司),超濾濃縮管-100 kD、過濾器-0.22 μm(Millipore公司,美國),RiboTMExosome Isolation Reagent(for other body fluids)(C10120-1,廣州市銳博生物科技有限公司),exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit(77064,德國QIAGEN公司),透射電子顯微鏡 (Tecnai G2 Spirit 120 kV,美國FEI公司),納米粒度電位儀(Zetasizer Nano ZSP,英國Malvern公司),超微量分光光度計(NanoDrop2000,美國Thermo公司),生物芯片分析系統(tǒng)(Agilent 2200,美國 Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1 容受期宮腔液樣本的準備

使用陰道涂片HE染色觀察大鼠陰道脫落細胞,確定動情周期階段。選擇觀察到兩個完整動情周期的雌鼠進入實驗,在動情期與雄鼠按1∶1比例合籠,第二日晨觀察陰栓或精子,有則記為Pd1。

Pd5收取宮腔液。用10%水合氯醛按0.3 mL/300 g麻醉大鼠后,腹部剃毛,在恥骨聯(lián)合上約1～2 cm處沿腹部正中線向上剪開約3～4 cm的創(chuàng)口。在膀胱后方尋找雙側(cè)宮頸匯合處,沿此向上小心分離出雙側(cè)子宮及卵巢,輕柔分離周邊的結(jié)締組織及血管,盡量減少組織碎片及血流對宮腔液的污染。溫鹽水浸濕無菌紗布,墊鋪在子宮與大鼠軀干之間,動脈夾沿著雙側(cè)宮頸匯合處夾閉子宮下端,用1 mL注射器抽取0.5 mL PBS,換4號針頭沿子宮下端穿刺進入宮腔,灌注約0.5 mL后子宮明顯充盈,等待片刻后用無菌顯微眼科剪沿輸卵管遠端,在子宮上端剪開創(chuàng)口,同時以1.5 mL無菌離心管收集宮腔灌洗液。宮腔液收集后,0.22 μm過濾器濾去組織碎片及細菌,4℃下2 500 g離心30 min,取上清。

合并6只大鼠宮腔液為一個樣本進行分析。使用超濾濃縮管4℃、4 000 g離心10 min,保留濾液作為后續(xù)Western-blot陰性對照,收集濃縮液(約300～500 μL),混勻后平均分配成兩份樣本進行EVs提取實驗。

1.2.2 子宮內(nèi)膜胞飲突表達情況的掃描電鏡觀察

隨機剪取約1 cm子宮,沿中線剖開,展平后用生理鹽水沖洗,浸泡于2.5%戊二醛電鏡固定液,使用掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察內(nèi)膜上皮的超微結(jié)構(gòu),通過胞飲突表達情況確定其處于容受期(圖1)。

1.2.3 沉淀法分離ULF-EVs

圖1 容受期可見子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育Fig.1 Fully developed pinopode can be observed during the phase of receptivity

按照RiboTMExosome Isolation Reagent(廣州市銳博生物科技有限公司)使用說明提取宮腔液EVs。將上述濃縮液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管,置于冰上,加入1/3體積的RiboTM試劑,混勻后,4℃靜置過夜;第二日對混合液進行4℃、1 500 g離心30 min,棄上清液,保存沉淀。需要進行后續(xù)實驗時,將PBS使用0.22 μm過濾器過濾后,重懸EVs沉淀,標記為R。

1.2.4 親和膜離心柱提取ULF-EVs

按照exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit-77064(QIAGEN公司,德國)使用說明提取宮腔液EVs。往濃縮液加入1.5倍體積的binding buffer XBP,顛倒混勻后室溫靜置5 min,轉(zhuǎn)換至離心柱,離心后棄洗脫液。往離心柱加入buffer XWP,離心洗去親和膜中的雜質(zhì),保留部分洗脫液。最后,往離心柱內(nèi)對著親和膜加入buffer XE,孵育1 min后離心,將洗脫液滴進同一親和膜,孵育1 min后離心,保存洗脫液,標記為Q。

1.2.5 EVs形態(tài)的透射電鏡觀察

該實驗在中南大學高等醫(yī)學中心生物醫(yī)學電鏡實驗室進行,設(shè)備使用Tecnai G2 Spirit 120 kV透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)。大致步驟如下：1)PBS先后經(jīng)過0.45 μm和0.22 μm過濾器備用。取上述宮腔液EVs洗脫液約20 μL,加入filtered-PBS稀釋5倍,混勻;2)取10 μL宮腔液EVs懸液滴至電鏡銅網(wǎng)狀柵,保留至少 20 min;3)1×PBS 50 μL固定 1 min,重復(fù)2～3次;4)4%戊二醛10 μL固定5 min后,濾紙吸干,1×PBS洗滌1次,室溫下自然晾干;5)將洗滌后的銅網(wǎng)置于電子顯微鏡下進行觀察。

1.2.6 EVs表面特征蛋白質(zhì)的Western-blot分析

R-重懸液和Q-洗脫液均使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,使用CD63(#Rabbit 1∶500,Proteintech)、TAPA-1/CD81(#Rabbit 1∶1 000,Proteintech)和 β-actin(#Mouse 1∶5 000,Proteintech)4℃孵育過夜。次日使用HRP標記的二抗(Proteintech)(鼠抗稀釋比例1∶5 000,兔抗稀釋比例1∶6 000)與膜共同孵育120 min。洗膜后顯色曝光。

1.2.7 粒徑分布的動態(tài)光散射測量

事先將純水經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后高溫消毒備用并設(shè)為陰性對照,分別與20 μL R-重懸液和20 μL Q-洗脫液混合至檢測所需的樣本量(約1 mL),緩慢注入一次性干凈粒徑樣品池,避免氣泡,使用無塵紙擦拭管壁光路。所有操作按照設(shè)備Zetasizer Nano ZSP(Malvern公司,美國)的使用說明書進行。

1.2.8 RNA的分離提取及分析

使用miRNeasy Micro Handbook(QIAGEN公司,德國)提取R-沉淀,使用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit提取Q-膜結(jié)合EVs。前者將R-沉淀與QIAzol混勻碎膜,樣本記為r,后者直接將QIAzol加入至親和膜中(免除XE洗脫EVs),樣本記為q。后續(xù)步驟大致相同,使用氯仿使裂解液液相分離,取上層液相利用親和膜原理逐步分離剔除雜質(zhì),最終用無酶水洗脫得到total RNA。使用超微量分光光度計(NanoDrop2000,美國Thermo公司)分析其純度(A260/280)及濃度。使用生物芯片分析系統(tǒng)-Agilent 2200(Agilent公司,美國)檢測濃度和片段分布。

1.2.9 圖像處理及統(tǒng)計分析

圖像處理使用 GraphPad Prism 7.0、Image-Pro Plus 6.0及Origin Pro 2015軟件包。統(tǒng)計分析使用SPSS 22.0軟件包。計量資料結(jié)果用±s表示,若方差齊采用t檢驗;方差不齊則采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以百分率表示,采用卡方檢驗。P值均為雙側(cè)概率,檢驗水準α=0.05,必要時進行校準。本文的差異顯著性采用字母標記法,同一圖表的同行(列)中,不同肩標字母表示組間具有統(tǒng)計學差異,大寫字母P＜0.01,小寫字母P＜0.05,無肩標則無統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 EVs的形態(tài)鑒定

利用TEM法觀察兩種試劑盒所提取EVs的形態(tài)(圖2),圖片分析使用Image-Pro Plus 6.0。我們發(fā)現(xiàn),PEG沉淀法提取的EVs聚集成團,離心柱提取的EVs顆粒分散,背景更為干凈(圖2A)。從得到的EVs亞群來看,PEG沉淀法提取多為外泌體,大小均一,可見多個圓形囊泡結(jié)構(gòu)聚集,離心柱提取的EVs則包含了外泌體和微囊泡兩種囊泡結(jié)構(gòu)(圖2B)。此外,PEG沉淀法中的雜質(zhì)表現(xiàn)為松散結(jié)合的粒子,結(jié)構(gòu)模糊;離心柱提取的雜質(zhì)大多表現(xiàn)為蛋白質(zhì)樣的矩形結(jié)晶(圖2C)。

圖2 EVs形態(tài)的TEM觀察Fig.2 Morphological observation of EVs under TEM

2.2 EVs表面特征蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

使用Western-blot鑒定EVs表面特征蛋白質(zhì),同時采用BCA法測量EVs表面蛋白質(zhì)濃度,結(jié)果見圖3。兩種方法提取的EVs均表達CD63和TAPA-1(圖3A),其中離心柱提取的Q-洗脫液中總蛋白質(zhì)的量較高,間接表明EVs濃度更高(圖3B),但Q-洗脫液中特征蛋白質(zhì)CD63和TAPA-1相對于內(nèi)參β-actin的表達量與R-重懸液中的表達量并無統(tǒng)計學差異(圖3C),因此我們認為親和膜離心柱得到的洗脫液中存在較多的蛋白質(zhì)污染。

圖3 EVs表面特征蛋白質(zhì)檢測Fig.3 Identification of specific surface proteins of EVs

2.3 EVs粒徑分布

采用動態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)對兩種方法提取的EVs進行粒徑分布分析,結(jié)果如圖4所示。R-重懸液第一個峰的范圍為4.8～15.69 nm,峰值8.7 nm,占比42.7%,第二個峰的范圍為58.8～458.7 nm,峰值141.8 nm,占比57.3%。Q-洗脫液第一個峰的范圍為46.12～73 nm,峰值59.56 nm,占比14.5%,第二個峰的范圍為131.5～385.4 nm,峰值258.5 nm,占比85.5%。與電鏡下的粒子分布相符合。

圖4 EVs粒徑分布Fig.4 Size distribution of EVs

2.4 兩種方法對內(nèi)含總RNA濃度和片段分布的影響

選取A260/2801.8～2.2間的樣本,測量總RNA濃度(表1)。我們發(fā)現(xiàn)PEG沉淀法得到的ULF-EVs的總RNA濃度更高。進一步對兩種方法提取的ULF-EVs總RNA進行片段分析,結(jié)果如圖5所示。兩種方法提取的EVs的RNA片段基本為小于200 nt的小片段峰,無明顯長片段峰,提示小RNA含量相對較高,可以進行后續(xù)sRNA(small RNA)研究。同時,我們發(fā)現(xiàn)R-重懸液在100 nt左右出現(xiàn)一個明顯高峰,Q-洗脫液的片段分布集中在20～40 nt,因此我們認為Q-洗脫液更適用于miRNA的建庫測序分析。

表1 RNA濃度測定結(jié)果Table1 Concentration of total RNA measured by NanoDrop 2000

圖5 RNA片段分布分析Fig.5 Analysis of RNA fragment distribution

3 討論

1985年,人們首次在體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中使用電鏡發(fā)現(xiàn)細胞正在向外釋放胞外囊泡[17]。彼時,這小小囊泡被認為是細胞拋棄的“垃圾”,并未引起人們的重視。隨著EVs調(diào)節(jié)免疫和癌癥增殖轉(zhuǎn)移作用的發(fā)現(xiàn)[18],人們逐漸認識到它可能是細胞間除了旁分泌、自分泌和遠距分泌以外的一種新形式。EVs根據(jù)形成方式大致分為三類[19]：1)外泌體,直徑30～100 nm,由細胞內(nèi)多囊泡體(multivesicular body,MVB)與細胞膜融合后,通過胞吐作用向外釋放至外環(huán)境,大小較為均一,經(jīng)典的電鏡圖片可以看見茶托樣結(jié)構(gòu);2)微囊泡,粒徑偏大,直徑100～1 000 nm,由細胞質(zhì)膜直接出芽釋放至外環(huán)境,大小欠均勻,電鏡下可呈現(xiàn)不規(guī)則樣形狀的電子高密度影,由膜結(jié)構(gòu)樣低密度影包繞;3)凋亡小體,為細胞凋亡過程中形成的1～4 μm的電子囊泡。近年來人們對EVs的研究熱度迅速上升,幾乎所有的細胞都可以分泌EVs[20～23],幾乎所有的生物體液都發(fā)現(xiàn)了 EVs[24～26],生殖系統(tǒng)也不例外[27～31]。

1986 年,Psychoyos[32]提出“容受期”(phase of receptivity)概念：在人類和哺乳動物存在一個共同現(xiàn)象,一次成功的種植要求母體和胚胎在時空上達到同步。這意味著,不僅胚胎需要發(fā)育至具有著床能力的囊胚階段,子宮內(nèi)膜也要進行相應(yīng)轉(zhuǎn)變進入容受狀態(tài)。子宮內(nèi)膜容受性(endometrial receptivity)指子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力,呈現(xiàn)出一定的時間性和空間性,因此也稱作胚胎植入的著床期或稱“種植窗”(window of implantation,WOI),在這個短暫開放的窗口期內(nèi),子宮內(nèi)膜的分泌能力及黏附分子的表達將發(fā)生一系列的改變,這樣才能對胚胎呈現(xiàn)接受狀態(tài)?；罨呐咛ヅc容受狀態(tài)的子宮內(nèi)膜相互識別交流,共同完成種植。宮腔液主要由子宮內(nèi)膜上皮分泌而來,其理化性質(zhì)[15]和內(nèi)含的生物活性分子[14]都會受到子宮內(nèi)膜上皮的即時性調(diào)節(jié),比如：胚胎種植期間高水平的雌激素會影響內(nèi)膜上皮的“水通道”,從而形成過多的宮腔液[33]。母體的應(yīng)激和營養(yǎng)狀態(tài)都會影響宮腔液內(nèi)含的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和游離的核酸等生物分子,其中,在宮腔液發(fā)現(xiàn)的胞外囊泡成為了后起之秀。

目前提取EVs的常見方法[34]有：1)梯度超速離心法[35]。此為經(jīng)典提取方法,在梯度離心下層層剔除細胞碎片等雜質(zhì),但對設(shè)備要求高,提取時間長,且高速離心所產(chǎn)生的剪切力可能對囊泡結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。另外,對樣本量也有要求,無法對類似本研究的少量樣本進行提取;2)免疫磁珠法。該方法可特異性地與靶物質(zhì)結(jié)合,可以更有針對性地面向特定人群或者特定的細胞系提取EVs,但該方法效率低,EVs生物活性易受pH和鹽濃度影響,不利于下游實驗;3)色譜法[36]。其利用凝膠孔隙的孔徑大小與囊泡尺寸的相對關(guān)系對樣本進行分離,由此分離得到的囊泡在電鏡下大小均一,但需要使用特定的色譜柱進行提取,價格較貴,耗材不易獲得;4)沉淀法。該方法主要利用聚乙二醇可與疏水性蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀的特性來沉淀EVs,但其純度和回收率低,雜蛋白較多(假陽性),顆粒大小不均一,易產(chǎn)生難以去除的聚合物。隨著對EVs理化性質(zhì)認識的加深,現(xiàn)已有更多的提取方法面世,比如：哈佛醫(yī)學院團隊研發(fā)的新型微流體芯片裝置[37],本實驗中使用的QIAGEN公司研發(fā)的親和膜離心柱。遺憾的是,到目前為止仍然沒有一種方法能同時保證外泌體/微囊泡的含量、純度、生物活性。

在早期宮腔液EVs的研究中,人們采用梯度超速離心法及PEG沉淀法(ExoQuick-TC)分離人和哺乳動物的宮腔液EVs[13,38],鑒定結(jié)果提示PEG沉淀法也能達到與經(jīng)典超速離心法同樣的EVs提取效果。在某些提取細胞上清外泌體的實驗中甚至還發(fā)現(xiàn),PEG沉淀法比傳統(tǒng)離心法具有更高的產(chǎn)量和純度[39],提取時間縮短至4～6 h(Exo-Quick-TC)。在本實驗中,我們選取了一款年輕產(chǎn)品——親和膜離心柱與PEG沉淀法進行比較。該方法通過將生物液體中的EVs結(jié)合在親和膜中,利用生物流體特性將膜中雜質(zhì)逐步洗脫達到純化的目的,避免了添加物的污染,且操作大大簡化,提取時間縮短至1 h。當需要進行RNA提取實驗時,可以直接將裂解液加入至親和膜中反應(yīng),大大節(jié)省了操作步驟。有研究者成功用該方法提取了血清[40]和卵泡液[41]中的EVs,基本上能達到傳統(tǒng)離心法的提取效果。目前,該試劑盒從宮腔液樣本中提取EVs的應(yīng)用還鮮見報道。

在本實驗中,超濾濃縮后的宮腔液樣本量大約為300～500 μL,將其平均分配成兩個樣本后分別使用PEG沉淀法和親和膜離心柱進行提取。TEM形態(tài)鑒定結(jié)果顯示,兩種方法都可觀察到囊泡樣結(jié)構(gòu),沉淀法的EVs聚集成團,顆粒大小分布平均,背景污染物較多;親和膜法的EVs顆粒分散,可見外泌體及微囊泡樣囊泡結(jié)構(gòu),背景干凈,存在蛋白質(zhì)晶體樣矩形顆粒物污染。兩種方法提取的EVs均表達外泌體表面特征蛋白質(zhì)CD63、TAPA-1,其中親和膜法的EVs濃度更高,但因為兩組的表面特征蛋白質(zhì)相對于β-actin的相對表達量并沒有明顯差異,結(jié)合電鏡下對Q-洗脫液雜質(zhì)的觀察,我們認為親和膜法獲得的洗脫液中存在較多蛋白質(zhì)污染的情況。粒徑分析顯示兩種方法都不能準確分離外泌體和微囊泡,PEG沉淀法的重懸液中存在10 nm左右的粒子雜質(zhì)。盡管EVs的研究在近年來成為一大熱門,囊泡在細胞間的通訊、藥物載體等臨床應(yīng)用潛能引人矚目,但是其生物活性研究的前提在于保證提取的純度,因此本實驗的主要目的在于對比兩款試劑盒在少量樣本中提取EVs的效果,在生物活性方面簡單探討了兩種提取方法對EVs內(nèi)容物RNA的影響。結(jié)果顯示,兩款試劑盒提取的宮腔液EV RNA都可以滿足后續(xù)sRNA的實驗要求,其中沉淀法獲得的RNA濃度雖然更高,但在100 nt左右出現(xiàn)一個明顯高峰,而親和膜法洗脫液的RNA片段分布集中在20～40 nt,因此我們認為親和膜法更適用于miRNA的建庫測序分析。另外需要指出的是,本研究中選購的PEG沉淀試劑盒價格較低,較離心法時間縮短,但仍需要4℃過夜;親和膜離心柱試劑盒價格較高,需要特定的耗材,但無需過夜,提取時間極大縮短,從獲得宮腔液到最終提取EV RNA只需要2～3 h。

得益于膜結(jié)構(gòu)對運載分子的保護,EVs具有成為臨床診斷標志物的潛力。隨著人們對它們的理化性質(zhì)、形成方式[42,43]、靶向運輸機制[16]等各個生物過程研究的深入,利用EVs進行藥物運輸和靶向治療也逐漸成為可能。但針對EVs生物活性的研究前提是保證其提取純度,因此就目前來說,對EVs及其亞群的提取純化仍然是首要克服的關(guān)鍵問題。在本研究中,我們選擇大鼠容受期的少量宮腔液作為研究對象,使用PEG沉淀法和親和膜離心柱兩款試劑盒提取宮腔液胞外囊泡并進行比較。這兩種方法相對于傳統(tǒng)離心法來說,對樣本量要求低,設(shè)備耗材容易獲得,操作簡單,耗時短。我們的實驗證明了這兩款試劑盒都可以成功從少量的宮腔液中分離得到EVs。其中,親和膜離心柱提取法價格更高,耗時短,提取的EVs濃度更高,RNA片段集中在20～40 nt,更適用于miRNA的建庫測序。

綜上所述,本實驗為后續(xù)進一步研究宮腔液EV miRNA對胚胎著床的調(diào)控機制提供了方法學基礎(chǔ)。