基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的人成神經(jīng)瘤SK-N-SH細胞CAPNS1基因的靶向敲除

朱家佳,龍鼎新

(南華大學公共衛(wèi)生學院,中國湖南衡陽421001)

鈣蛋白酶(calpain)是一組高度保守的特異性Ca2+依賴性細胞內(nèi)中性蛋白酶,其活性主要與細胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)[1,2]。Calpain在機體的生理過程中發(fā)揮著重要作用,其不僅與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的水解有關(guān),還參與細胞自噬、細胞周期調(diào)控與凋亡、細胞骨架重構(gòu)、葡萄糖轉(zhuǎn)運、細胞信號轉(zhuǎn)導等正常的生理過程[3,4]。自Guroff[5]在大鼠的腦組織中首次發(fā)現(xiàn)一種可溶性Ca2+依賴的中性蛋白酶以來,研究者們越來越關(guān)注這種蛋白酶在體內(nèi)的作用。目前,研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中calpain存在15種亞型,其中,calpain1(μ-calpain)和 calpain2(m-calpain)在體內(nèi)廣泛表達,且研究也較為廣泛[6]。Calpain1和calpain2主要由80 kD的大亞基和30 kD的小亞基(calpain small subunit 1,CAPNS1)組成,CAPNS1是calpain1和calpain2活性所必需的,而且也是細胞遷移、凋亡和存活所必需的[7]。

基因編輯技術(shù)是指在基因組水平精確地進行基因編輯,其是通過精確識別靶細胞DNA片段中靶點的核苷酸序列,利用核酸內(nèi)切酶對DNA靶點序列進行切割,從而完成對靶細胞DNA目的基因片段的敲除、加入等過程。繼鋅指核酸酶(zincfinger nuclease,ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)基因編輯技術(shù)之后,第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas技術(shù)是目前運用最為廣泛的基因技術(shù)。相比ZFN和TALEN,CRISPR/Cas技術(shù)具有成本低、可同時進行多位點編輯、效率高等優(yōu)勢[8]。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌或古細菌中的一種適應性免疫系統(tǒng),用以抵御外來質(zhì)?；蚴删w的入侵[9]。根據(jù)Cas基因序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為3種類型,其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)需要多個Cas蛋白形成復合體切割DNA雙鏈;而Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)即CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需要一個Cas9蛋白核酸酶即可對DNA雙鏈進行切割,因此其最為簡單并被廣泛地應用于生命科學研究。該系統(tǒng)主要包含非特異性Cas9核酸酶和sgRNA兩部分,其中sgRNA具引導和檢測作用;Cas9是一種RNA依賴的DNA內(nèi)切核酸酶,其利用單一向?qū)NA(sgRNA)使雙鏈DNA斷裂,起到剪刀的作用[10]。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)calpain參與了細胞自噬的調(diào)節(jié)過程(結(jié)果尚未發(fā)表)。為進一步研究其機制,本文利用CRISPR/Cas9技術(shù)進行CAPNS1基因敲除,為后期研究calpain在自噬中的作用提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pGK1.1載體(江蘇吉銳生物有限公司)、Bbs I內(nèi)切酶和buffer(NEB公司,美國)、T4 DNA ligase和 buffer(Thermo Fisher Scientific 公司,美國)、質(zhì)粒抽提試劑盒(Axygen公司,美國)、Top10感受態(tài)細胞[生工生物工程(上海)股份有限公司]、SK-NSH細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)、MEM 培養(yǎng)基(Sigma公司,美國)、胎牛血清(Biological Industries公司,以色列)、Genloci基因抽提試劑盒和CruiserTM酶(江蘇吉銳生物有限公司)、BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、mouse anti-calpain1(Sigma 公司,美國)、rabbit anti-calpain2和rabbit anti-CAPNS1(Abcam公司,英國)。

1.2 方法

利用 NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫獲得CAPNS1基因在染色體的信息以及所有轉(zhuǎn)錄本公共的CDS區(qū),同時找出公共CDS區(qū)所處的外顯子進行靶位點設(shè)計。

1.2.1 CRISPR/Cas9敲除靶位點設(shè)計和寡核苷酸鏈合成

根據(jù)CRISPR/Cas9敲除靶位點即gRNA設(shè)計原則,通過在線軟件(http：//crispr.mit.edu/)設(shè)計靶序列,然后根據(jù)分值大小篩選出CAPNS1外顯子區(qū)域3′端有PAM元件NGG(N為任意的核苷酸)的20 bp連續(xù)的堿基序列。PAM序列區(qū)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮作用的基本條件,如果靶序列沒有PAM序列,Cas9蛋白將不會對靶位點進行切割[11]。根據(jù)oligo DNA進行引物合成,引物合成需在靶序列頭部添加額外的堿基,其中正向引物添加cacc,反向引物添加aaac。靶序列的第一個堿基必須是G,若不是,可自行在靶序列前加一個G。

1.2.2 pGK1.1-sgRNA敲除載體構(gòu)建

將合成后的兩條單鏈oligoDNA稀釋成10μmol/L,退火形成dsDNA,再與線性化后的pGK1.1載體連接。退火反應體系如下：正負鏈oligo各10 μL,10× annealing buffer 4 μL,ddH2O 16 μL,總體積40 μL。將以上體系瞬時離心,置于PCR儀中95℃孵育3 min,然后自然冷卻至溫度下降到40℃以下,獲得充分雜交的DNA。取1 μL雜交后的ds-DNA進行T4 DNA ligase連接反應,反應體系如下：pGK1.1 線性質(zhì)粒 1 μL,雜交后的 dsDNA 1 μL,T4 DNA ligase 0.5 μL,10× T4 DNA ligase buffer 1 μL,ddH2O 6.5 μL,總體積 10 μL。將以上體系瞬時離心后,放于PCR儀中16℃孵育30 min進行連接反應。然后轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細胞中,均勻涂布于含Kan抗性的篩選平板上,倒置培養(yǎng)過夜。使用上游引物VSP primer與下游負鏈oligo引物進行菌落PCR篩選,陽性克隆PCR正確大小應為100 bp。對篩選到的陽性克隆進行質(zhì)粒提取并送往南京一道生物科技有限公司進一步測序驗證。

1.2.3 電轉(zhuǎn)染SK-N-SH細胞及單克隆的制備和生長

SK-N-SH細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清MEM培養(yǎng)基、5%CO2、37℃恒溫箱條件下。轉(zhuǎn)染前,取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期SK-N-SH細胞懸液進行臺盼藍計數(shù),確定細胞數(shù)及細胞活力(細胞活力＞95%)。取5×106個細胞于15 mL離心管中,以轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心4 min,棄上清。將細胞沉淀懸浮于210 μL DPBS中,轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,加入CAPNS1基因敲除質(zhì)粒5～8 μg(質(zhì)粒濃度要求1 g/L以上),輕輕混勻,進行共轉(zhuǎn)染。24 h后,加入含最佳嘌呤霉素篩選濃度(1 μg/mL)的完全培養(yǎng)基進行藥篩,2～5 d后,利用有限稀釋法使最終96孔板中每孔細胞數(shù)為1個。1周后觀察單克隆生長情況,約兩周后將長起來的單克隆轉(zhuǎn)移至48孔中擴大培養(yǎng);當細胞長滿48孔1/2時,即可取出一部分(102～104),使用Genloci TNA抽提試劑盒(cat.no.GP0155,GP0156)提取細胞基因組。

1.2.4 篩選基因敲除陽性克隆

PCR雜交獲得雜交DNA,其反應條件如下：野生型DNA和突變型DNA各25 ng,2.5 μL 10×G-Taq buffer,1.5 μL Mg2+buffer,0.5 μL dNTP(10 mmol/L),上游引物(AAGCCATGGAGACACTATGC)和下游引物(TGGTCCATAGAGGTCATAGG)各1 μL,0.25 μL G-Taq DNA聚合酶。PCR儀中95℃預變性1.5 min,變性10 s,55～62℃退火10 s,72℃延伸20 s,徹底延伸5 min,此循環(huán)進行35次。自然冷卻至40℃以下,獲得雜交DNA。取2 μL PCR產(chǎn)物、2 μL CruiserTMbuffer、1 μL CruiserTM酶,雙蒸水補充至10 μL。45℃反應20 min后立即向上述 10 μL 反應體系內(nèi)加入 2 μL 6× stop buffer,隨后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測或置于-20℃保存。將CrusierTM酶切初步篩選出來的陽性克隆送往南京一道生物科技有限公司進行測序驗證,進一步確認陽性克隆。對于兩個等位基因突變情況不一樣的陽性克隆,重新做TA克隆后送測序,跟野生型比對,確定每個等位基因的突變情況。

1.2.5 Western-blot檢測

提取野生型SK-N-SH細胞(CAPNS1+/+)和突變型SK-N-SH細胞(CAPNS1-/-)的總蛋白質(zhì),用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉2 h,然后分別加入mouse anti-calpain1(1∶1 000)、rabbit anti-calpain2(1∶1 000)、rabbit anti-CAPNS1(1∶1 000)、rabbit anti-actin(1∶1 000),4℃孵育過夜。吸走一抗,TBST洗3遍,加入二抗(1∶3 000)37℃孵育1 h,TBST洗5遍。最后用凝膠成像系統(tǒng)進行顯影,檢測蛋白質(zhì)表達情況。

2 結(jié)果

2.1 CAPNS1基因信息和靶位點設(shè)計與合成

從NCBI中獲得人CAPNS1基因(ID：826)位于19號染色體(NC_000019.10),具有4套不同的轉(zhuǎn)錄本,序列號分別為：NM_001003962.2、NM_001302632.1、NM_001302633.1、NM_001749.3。選取CAPNS1基因所有轉(zhuǎn)錄本公共的CDS區(qū)域中的外顯子進行靶位點設(shè)計,所獲得的3個sgRNA靶位點序列信息及相對應的靶標寡核苷酸序列見表1。

2.2 pGK1.1載體圖譜及酶切鑒定

pGK1.1質(zhì)粒包含了Cas9核酸酶表達框和gRNA克隆框兩個重要原件,其圖譜如圖1所示,大小為10 656 bp。VSP primer(CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG)序列位于載體的U6啟動子區(qū)域。下游負鏈oligo序列即靶位點的反向互補序列,位于載體的雙Bbs I酶切位點,靶位點替換雙Bbs I酶切位點。載體經(jīng)酶切后,獲得10 kb左右片段(圖2)。

表1 sgRNA靶位點序列及靶標寡核苷酸序列Table1 sgRNAs and target oligonucleotide sequences

圖1 pGK1.1質(zhì)粒圖譜Fig.1 The pGK1.1 plasmid map

圖2 pGK1.1載體酶切后的電泳檢測圖Fig.2 The electrophoretic pattern of pGK1.1 vector digested by Bbs I

2.3 陽性重組子篩選與鑒定

使用上游引物VSP primer與下游負鏈oligo引物進行菌落PCR篩選,均能擴增出100 bp大小的片段,說明所檢測單克隆全為陽性(圖3)。進一步對擴增結(jié)果展開測序鑒定,并將測序結(jié)果與NCBI所提供的序列進行比對,結(jié)果顯示測序正確,即載體構(gòu)建成功。

圖3 菌落PCR檢測電泳圖Fig.3 Electrophoresis of the colony PCR products

2.4 CruiserTMEnzyme酶切篩選陽性克隆

將構(gòu)建好的3個載體共同轉(zhuǎn)染到SK-N-SH細胞中,制備單克隆,進行CruiserTMEnzyme酶切驗證。根據(jù)擴增引物及理論敲除位點位置,擴增產(chǎn)物約455 bp,擴增出的目的條帶大小明顯變小或者可以切出條帶的克隆為疑似陽性克隆。CAPNS1基因敲除SK-N-SH單克隆細胞經(jīng)CruiserTMEnzyme酶切后,在400～500 bp之間出現(xiàn)條帶,疑似為陽性克隆(圖4)。

圖4 CAPNS1基因的CruiserTM酶切驗證Fig.4 CruiserTMEnzyme analysis of the CAPNS1 gene

2.5 單克隆測序以及TA克隆測序

將疑似陽性的SK-N-SH細胞單克隆進行單克隆測序和TA克隆測序。單克隆測序顯示細胞株構(gòu)建成功(圖5);TA克隆測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)兩個親本都缺失35 bp：TCAGGGACCATTTGCAGTAGTGAACTCCCAGGTGC(圖6)。以上結(jié)果提示,CAPNS1基因敲除SK-N-SH細胞株構(gòu)建成功。

2.6 Western-blot檢測 CAPNS1、calpain1 和calpain2蛋白的表達情況

對CAPNS1基因敲除SK-N-SH穩(wěn)定細胞系中的CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白的表達情況進行Western-blot分析。結(jié)果顯示,與對照組SK-N-SH細胞(CAPNS1+/+)相比,CAPNS1基因敲除SK-N-SH穩(wěn)定細胞系(CAPNS1-/-)中的CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白表達水平均明顯降低(圖7)。

3 討論

圖5 CAPNS1基因敲除SK-N-SH細胞系的單克隆測序Fig.5 Colony sequencing of CAPNS1 knockout SK-N-SH cells

圖6 CAPNS1基因敲除SK-N-SH細胞的TA克隆測序及比對Fig.6 TA cloning and alignment of CAPNS1 knockout SK-N-SH cells

圖7 CAPNS1敲除后CAPNS1、calpain1和 calpain2蛋白的表達情況Fig.7 The expression of CAPNS1,calpain1 and calpain2 proteins in CAPNS1 knockout SK-N-SH cells

作為機體主要存在的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)之一,calpain系統(tǒng)在細胞生存中具有重要作用。大量研究表明,calpain活性過渡增加或抑制與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),如神經(jīng)退行性疾病[12]、白內(nèi)障[13]、糖尿病[14]等。CAPNS1作為 calpain1和calpain2共同擁有的小亞基結(jié)構(gòu),對calpain1和calpain2活性起著調(diào)節(jié)作用。CAPNS1由結(jié)構(gòu)域Ⅴ和結(jié)構(gòu)域Ⅵ兩個結(jié)構(gòu)域組成。結(jié)構(gòu)域Ⅴ含有大量甘氨酸和疏水氨基酸,具有疏水作用;結(jié)構(gòu)域Ⅵ位于C端,與大亞基結(jié)構(gòu)域Ⅳ的結(jié)構(gòu)相似,能與Ca2+結(jié)合,對維持calpain功能具有重要的作用。研究表明,CAPNS1基因敲除可導致calpain1及calpain2失活,影響小鼠心臟發(fā)育,從而造成其在妊娠中期死亡,提示calpain在生物的生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[15]。此外,有研究報道,CAPNS1對細胞自噬具有調(diào)節(jié)作用[3]。本課題組前期研究以及其他研究發(fā)現(xiàn),calpain1和calpain2表達及活性的增加參與細胞自噬的調(diào)節(jié)[12],但其機制至今還不是十分清楚,需進一步的研究。

自從傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)被改造：將兩個非編碼RNA即crRNA和tracrRNA合成一個sgRNA,指引Cas9蛋白對靶標DNA序列進行編輯,CRISPR/Cas9系統(tǒng)應用越來越廣泛[16]。人們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)實現(xiàn)了研究不同類型基因組的目的,其不僅可作為基因編輯的工具,也可用于基因表達調(diào)控[17]。如今,CRISPR/Cas9技術(shù)已成功地被運用到人類細胞[18]、小鼠[19]、斑馬魚[20]、豬[21]等進行實驗研究。但CRISPR/Cas9技術(shù)會受到PAM序列、sgRNA序列、Cas9/sgRNA的豐度等多種因素的影響,從而產(chǎn)生脫靶效應。對于降低CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶效應,我們可通過提高sgRNA序列設(shè)計的特異性、控制Cas9/sgRNA的豐度、采用雙切口措施等策略實現(xiàn)。

本研究選擇了同時包含Cas9核酸酶表達框和sgRNA克隆框的pGK1.1質(zhì)粒作為載體,針對人CAPNS1基因進行敲除載體的構(gòu)建。菌落PCR和測序結(jié)果顯示CAPNS1基因敲除載體構(gòu)建成功,進一步將其轉(zhuǎn)染人成神經(jīng)瘤SK-N-SH細胞,獲得穩(wěn)定單克隆細胞系,測序結(jié)果及Westernblot檢測結(jié)果提示敲除CAPNS1基因的SK-NSH細胞系構(gòu)建成功。以上實驗結(jié)果為后期進一步研究calpain在自噬中的作用提供了良好的細胞模型。