兒童腎上腺皮質(zhì)癌表達(dá)譜時(shí)序分析用于篩選相關(guān)靶點(diǎn)的研究

韓媛媛，李笑各，王書煥，劉戈力

腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical tumor，ACT）是一種罕見的內(nèi)分泌腫瘤，發(fā)病率約5/10萬～20/10萬，ACT往往是致命的惡性腫瘤，5年生存率只有20%～35%［1］。ACT在兒童癌癥中的占比（1.3%）遠(yuǎn)高于在成年人（0.02%～0.20%）［2］。ACT可以分為4個(gè)分級（stage）：stage 1和stage 2定義為腎上腺皮質(zhì)瘤，stage 3會浸潤到周圍組織或局部區(qū)域淋巴結(jié)，stage 4則會表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移性。在過去的10年中，通過DNA微陣列分析基因表達(dá)譜為許多實(shí)體瘤的分類和預(yù)后預(yù)測提供了一種新技術(shù)［3-4］。既往的基因表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)，基因L13RA2、HTR2B、CCNB2、RARRES2和SLC16A9可用于區(qū)分ACT的良惡性［5］，且IGF-Ⅱ基因集的高表達(dá)和steroidogenesis基因集的低表達(dá)可作為惡性ACT的預(yù)測指標(biāo)［6］。兒童ACT的MicroRNA表達(dá)譜研究則揭示了miR-99a和miR-100表達(dá)下調(diào)使得胰島素樣生長因子-Ⅰ受體（IFG-1R）、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）和mTOR復(fù)合體調(diào)控相關(guān)蛋白（RPTOR）的過表達(dá)［7］。另外，可以根據(jù)有絲分裂活性和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平幫助確定ACT的亞型［8］。對于ACT生存期相關(guān)基因的研究表明，DLG7和PINK1聯(lián)合表達(dá)水平可預(yù)測無病生存情況，而BUB1B和PINK1聯(lián)合表達(dá)水平則可用來預(yù)測總體存活率［9］。絲裂原活化蛋白激酶相關(guān)基因和生長因子受體信號通路相關(guān)基因在兒童ACT中的表達(dá)下調(diào)，表明其可以一定程度上反映治療狀況［10］。雖然這些研究已經(jīng)推動了這一領(lǐng)域的發(fā)展，然而目前有關(guān)ACT的致病機(jī)制仍不明確，尤其對兒童ACT生存期相關(guān)研究更少。因此，本研究選取了兒童ACT相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)，對各個(gè)分級的兒童ACT進(jìn)行研究，以期對兒童ACT獲得更多了解。

1 材料與方法

1.1 材料 從Gene Expression Omnibus（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）選取了兒童ACT相關(guān)RNA芯片數(shù)據(jù)集GSE75415，該數(shù)據(jù)集基于Affymetrix Human Genome U133A Array（GPL96）芯片平臺進(jìn)行信使RNA（mRNA）表達(dá)譜的測定。共包含31個(gè)樣本：5個(gè)腎上腺皮質(zhì)腺瘤組織樣本、18個(gè)ACT組織樣本、1個(gè)未確定樣本及7個(gè)正常腎上腺皮質(zhì)組織樣本。本研究只保留了18個(gè)ACT組織樣本（實(shí)驗(yàn)組）以及7個(gè)正常腎上腺皮質(zhì)組織樣本（對照組）。18個(gè)ACT樣本處于stage 1的樣本4個(gè)、stage 2的樣本6個(gè)、stage 3的樣本5個(gè)、stage 4的樣本3個(gè)。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)基因篩選 使用R語言Affy包中的RMA函數(shù)對各樣本表達(dá)量進(jìn)行去背景噪聲，標(biāo)準(zhǔn)化，得到標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)值矩陣。引入limma包進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，以實(shí)驗(yàn)組相對于對照組變化倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）的對數(shù)值log2|Fold Change|＞1以及校正值P＜0.05（Benjamini&Hochberg方法）作為選取差異表達(dá)基因的閾值。分別將18個(gè)ACT樣本的各分期的表達(dá)情況與對照組的7個(gè)正常腎上腺組織樣本的表達(dá)情況進(jìn)行輪流比較，篩選各個(gè)分級相對于對照組的差異表達(dá)基因（DEGs），并取得各分級間DEGs的交疊部分作為重合差異基因（OLDEGs）。

1.2.2 功能富集分析 使用R語言的clusterProfile包對各分級的DEGs進(jìn)行KEGG通路分析以及GO功能富集分析。以假陽性率FDR＜0.05作為選取富集功能項(xiàng)的閾值。此外，對各分級間的OLDEGs用DAVID（Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,http://david.abcc.ncifcrf.gov）進(jìn)行GO生物過程（Biological Process）富集分析，使用cytoscape中的enrichment Map插件進(jìn)行OLDEGs的GO富集可視化結(jié)果以觀察各個(gè)生物過程之間的相互聯(lián)系。

1.2.3 中心基因篩選將各癌癥分級中的DEGs的log2（FC）值進(jìn)行可視化，選取癌癥4個(gè)階段中均有同樣差異表現(xiàn)的DEGs作為中心基因，這些中心基因在各個(gè)癌癥階段中皆具有表達(dá)共性，可以作為ACT的特異性基因?；虮磉_(dá)水平高低通過log2（FC）的符號來判斷，當(dāng)log2（FC）為正時(shí)，表示在ACT中高表達(dá)，log2（FC）為負(fù)時(shí)，表示在ACT中低表達(dá)。

1.2.4 生存分析使用R語言的cgdsr包下載cbioportal（http://www.cbioportal.org/）中腎上腺癌的TCGA數(shù)據(jù)集，其中包括79個(gè)ACT樣本的二代測序數(shù)據(jù)。引入Survival包對OLDEGs進(jìn)行生存分析，檢驗(yàn)方法為Log-rankχ2檢驗(yàn)，保留表達(dá)量與生存時(shí)間存在顯著相關(guān)性的生存結(jié)果，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選 相對于對照組的7個(gè)正常樣本，stage1～4樣本組分別存在248、334、315和561個(gè)DEGs，如圖1所示?？梢姼鞣旨墭颖窘M與對照組均聚類成獨(dú)立的2組，存在明顯差異表達(dá)。

4個(gè)分級樣本組存在73個(gè)OLDEGs，這73個(gè)OLDEGs在各分級樣本組表達(dá)量熱圖見圖2A；各個(gè)分級之間的差異表達(dá)基因重合情況見圖2B。可見各分級之間有明顯的表達(dá)差異，也有部分基因在各分級中表達(dá)情況一致。

2.2 功能富集分析 各分級間DEG的KEGG通路富集見圖3A，stage 1～4樣本組分別有2、7、6和7條通路富集。各分級間DEG的GO富集結(jié)果見圖3B，可見Stage 1～4樣本組分別在5、9、7和8個(gè)過程富集，其中molecular_function，protein binding和binding這3個(gè)過程在各個(gè)分級中均表現(xiàn)明顯富集。圖3C展示了各個(gè)分級間DEG的KEGG富集結(jié)果重合情況，其中各個(gè)分級均包含cell cycle這一通路。圖3D展示了各個(gè)分級間DEG的GO富集結(jié)果重合情況。

對73個(gè)OLDEGs的GO富集結(jié)果通路進(jìn)行串話分析見圖4，所有的通路大概分為4個(gè)主要的功能模塊：免疫相關(guān)功能、細(xì)胞周期相關(guān)功能、磷酸化相關(guān)功能以及凝血相關(guān)功能。另外，對73個(gè)OLDEGs進(jìn)行KEGG富集分析，得到46個(gè)富集通路，其中多條通路與代謝、感染和信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，見表1。

2.3 中心基因篩選 對各個(gè)分級中的DEGs進(jìn)行分析，篩選得到12個(gè)中心基因，其中HSPA13、GARS、STXBP1、AKIRIN1、TUBB3這5個(gè)基因在各分級中均上調(diào)，ADH1B、DCN、RASSF2、PDGFRA、PLAT、C3、FOS這7個(gè)基因在各分級中均下調(diào)，見表2。

2.4 生存分析 對TCGA數(shù)據(jù)集中79個(gè)ACT樣本的二代測序數(shù)據(jù)進(jìn)行73個(gè)OLDEGs生存分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)基因與ACT的生存相關(guān)，它們的生存曲線見圖5。其中基因XPO1、RACGAP1、PDGFD、NR4A2和MXRA5的高表達(dá)會導(dǎo)致ACT患者的生存時(shí)間縮短；而VPS51、TMED3、NDFIP1和CDKN1C高表達(dá)的ACT患者生存時(shí)間延長（P＜0.05）。

Fig.3 Functional enrichment analysis圖3 功能富集

3 討論

數(shù)據(jù)集GSE75415曾經(jīng)被用于兒童ACT的表達(dá)譜分析，以方便對兒童ACT診斷和預(yù)后的了解，但相關(guān)研究中缺乏相關(guān)DEGs的生存期分析［11］。不同于既往研究，本研究旨在通過對正常樣本和4個(gè)分級ACT的表達(dá)譜進(jìn)行分析與比較，探索ACT的發(fā)病機(jī)制，并通過對相關(guān)基因的生存期分析，篩選與ACT治療相關(guān)的靶點(diǎn)。

Fig.4 Crosstalk analysis of GO terms of 73 OLDEGs圖4 73個(gè)OLDEGs顯著富集通路之間的通路串化分析

Fig.5 Kaplan-Meier curve of ACT survival associated genes圖5 ACT生存相關(guān)基因的生存分析

3.1 DEG篩選及功能富集分析 與對照組正常樣本相比，在stage1～4的ACT樣本中，分別有248、334、315和561個(gè)基因發(fā)生了差異表達(dá)。對stage1～4樣本組的DEG進(jìn)行KEGG功能富集分析發(fā)現(xiàn)，各個(gè)分級均包含cell cycle、molecular_function、protein binding和binding通路。4個(gè)分級樣本組間存在73個(gè)OLDEGs，12個(gè)中心基因中HSPA13、GARS、STXBP1、AKIRIN1、TUBB3在4個(gè)分級中均上調(diào)，基因ADH1B、DCN、RASSF2、PDGFRA、PLAT、C3、FOS在4個(gè)分級中均下調(diào)。對73個(gè)OLDEGs進(jìn)行富集功能分析發(fā)現(xiàn)，富集通路大多分布在免疫相關(guān)功能，細(xì)胞周期相關(guān)功能，磷酸化相關(guān)功能模塊以及凝血相關(guān)功能，且多條KEGG富集通路與代謝，感染和信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

Tab.1 Significantly enriched KEGG pathways of 73 OLDEGs表1 73個(gè)OLDEGs的KEGG通路富集結(jié)果

續(xù)表

Tab.2 The twelve core genes表2 12個(gè)中心基因

基因GARS、PLAT和C3與腫瘤免疫功能密切相關(guān)。GARS編碼的蛋白是人類自身免疫性疾病、多發(fā)性肌炎或皮肌炎的自身抗體的目標(biāo)。C3基因編碼的補(bǔ)體C3在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活中起著決定性作用。PLAT和C3均參與Complement and coagulation cascades途徑。Anurag等［12］研究表明，Complement and coagulation cascades途徑在ACT中下調(diào)，這可能與PLAT和C3的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。因此，筆者推測GARS、PLAT和C3通過影響免疫相關(guān)功能影響ACT的發(fā)生與發(fā)展。

基因TUBB3、DCN、RASSF2和FOS與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控密不可分。TUBB3在腦腫瘤（85%～100%）、肺癌（35%～80%）、胰腺癌（50%）、腎細(xì)胞癌（15%～80%）和惡性黑色素瘤（77%）中均有高表達(dá)［13］。研究表明，TUBB3的過表達(dá)與侵襲性膀胱癌的遺傳不穩(wěn)定性增加有關(guān)，而p53改變和細(xì)胞增殖迅速有關(guān)［14］。DCN低表達(dá)可促進(jìn)腎臟癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［15］。RASSF2在賁門癌、乳腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、上皮性卵巢癌，尤因肉瘤和宮頸癌中是一種新的抑癌基因［16-21］。研究表明，c-fos的表達(dá)缺失與卵巢癌的腫瘤進(jìn)展有關(guān)［22］。因此，筆者推測，ACT細(xì)胞周期相關(guān)功能的富集與TUBB3、DCN、RASSF2和FOS的差異表達(dá)有密切關(guān)系。另外，DCN蛋白還可通過與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，發(fā)揮抑制血管生成和腫瘤發(fā)生的作用。

基因PDGFRA下調(diào)可影響腫瘤細(xì)胞的磷酸化過程。癌細(xì)胞內(nèi)若有多條信號傳導(dǎo)途徑發(fā)生變化，則多與蛋白質(zhì)磷酸化有關(guān)。研究顯示，酪氨酸磷酸化是控制細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的幾個(gè)關(guān)鍵的致癌信號通路的一個(gè)精致開關(guān)［23］。PDGFRA編碼細(xì)胞表面酪氨酸激酶受體，在器官發(fā)育、傷口愈合和腫瘤進(jìn)展中起著重要作用。Pastor等［24］對6例無血緣關(guān)系的ACT患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，PDGFRA在患者中呈低表達(dá)。另外，HSPA13編碼熱休克蛋白70（HSP70）超級蛋白，可能通過影響蛋白分泌、清除變性或不正常折疊蛋白等過程，從而參與ACT的發(fā)生和發(fā)展［12］。ADH1B編碼的醇脫氫酶則可能通過影響各種底物代謝通路和藥物代謝參與ACT的發(fā)?。?4］。

綜上所述，Binding相關(guān)功能在各個(gè)分級中富集可能與STXBP1和AKIRIN1過度表達(dá)相關(guān)。NCBI數(shù)據(jù)庫關(guān)于STXBP1和AKIRIN1的介紹中提到，STXBP1編碼一種合成結(jié)合蛋白，與各種類型的binding密切相關(guān)，而AKIRIN1的表達(dá)與protein binding密切相關(guān)。

3.2 生存分析 本研究生存分析顯示，XPO1、RACGAP1、PDGFD、NR4A2和MXRA5的高表達(dá)，以及VPS51、TMED3、NDFIP1和CDKN1C的低表達(dá)與ACT患者的生存期密切相關(guān)。

XPO1編碼的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白可通過控制cyclin B、MPAK和MAPKAP激酶2的表達(dá)，參與部分細(xì)胞的生長過程。RACGAP1的高表達(dá)提示乳腺癌、胃癌和直腸癌的預(yù)后較差［25-27］，本研究亦顯示RACGAP1高表達(dá)的ACT患者預(yù)后不良。PDGFD基因參與Gap junction通路，相比正常細(xì)胞和良性細(xì)胞，ACT細(xì)胞間的gap junction數(shù)量顯著降低［28］。在大約60%的ACT患者均呈現(xiàn)出腎上腺類固醇激素過量現(xiàn)象，這可能與NR4A2編碼的激素-維生素A表達(dá)增加有關(guān)，且該受體參與Aldosterone synthesis and secretion通路［29］。另外有研究顯示，在腎小管細(xì)胞中MXRA5編碼蛋白表現(xiàn)出免疫活性［30］。而MXRA5編碼的蛋白包含12個(gè)免疫球蛋白樣的c2型域，因此筆者推測該基因可能通過影響免疫功能來發(fā)揮作用。

表達(dá)下調(diào)基因主要通過影響物質(zhì)運(yùn)輸與蛋白分泌影響預(yù)后。VPS51編碼的蛋白是高爾基體相關(guān)逆行蛋白復(fù)合物（GARP）的組成部分。TMED3編碼一種穿膜蛋白，參與從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的囊泡運(yùn)輸。DNFIP1編碼的蛋白屬于一組具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化保守蛋白，這種蛋白質(zhì)被認(rèn)為是高爾基體膜蛋白家族的一部分。目前這3個(gè)基因的作用機(jī)制還不清楚，根據(jù)3個(gè)基因的功能推測，它們應(yīng)該與物質(zhì)的運(yùn)輸和蛋白分泌有關(guān)系。另外研究顯示，TMED3基因的敲除增加了直腸癌的轉(zhuǎn)移生長［31］，本研究亦顯示，TMED3的低表達(dá)導(dǎo)致ACT的預(yù)后不良。CDKN1C編碼的蛋白對于幾種cyclin/CDK復(fù)合物有很強(qiáng)的抑制作用，并抑制細(xì)胞增殖，在成人ACT中也檢測到該基因的表達(dá)有所下調(diào)［32］。

綜上所述，通過ACT和正常組織樣本的表達(dá)譜分析，本研究篩選出了與ACT發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的靶點(diǎn)，并通過對重合差異基因的生存分析，確定了與ACT預(yù)后有密切關(guān)系的基因，這將有助于進(jìn)一步了解ACT的致病機(jī)制、治療和預(yù)后。

Fig.1 Heatmap of expression values of the DEGs圖1 差異表達(dá)基因的表達(dá)量熱圖

Fig.2 Analysis of the 73 OLDEGs圖2 73個(gè)OLDEGs的表達(dá)量分析