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    香榧幼胚發(fā)育與胚性感受態(tài)之間的相關(guān)性

    2018-09-28 08:41:40胡恒康胡淵淵喻衛(wèi)武吳家勝黃堅欽張啟香
    浙江農(nóng)林大學學報 2018年5期
    關(guān)鍵詞:體胚感受態(tài)胚性

    龔 麗,胡恒康, 胡淵淵, 喻衛(wèi)武,吳家勝,黃堅欽, 張啟香

    (1.浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術(shù)學院,浙江 杭州311300;2.浙江農(nóng)林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 浙江 杭州311300)

    植物胚性感受態(tài)為植物細胞或組織脫分化能力或潛力,胚性感受態(tài)的高低直接決定了植物體細胞胚誘導的難易程度[1]。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)植物的組織或細胞維持高水平胚性感受態(tài)的時間極短[2-3]。胚性感受態(tài)水平的高低與基因型、外植體的取材部位、生理學年齡等密切相關(guān)[4]。在黑核桃Juglans nigra中,授粉后3~4周的幼胚開始具有體胚發(fā)生能力,授粉后6~7周時幼胚體胚發(fā)生頻率最高,此后,體胚發(fā)生能力逐漸下降[5]。在梨Pyrus中,具有胚性感受態(tài)的時間極短,只有當梨幼胚發(fā)育期為魚雷胚至子葉胚時,才有少量體胚的誘導與發(fā)生[6]。榧樹Torreya grandis隸屬于裸子植物紅豆杉科Taxaceae榧屬Torreya常綠喬木。香榧Torreya grandis‘Merrillii’是實生榧樹中優(yōu)良變異類型或優(yōu)株經(jīng)人工嫁接繁殖而成的優(yōu)良品種,為中國特有的珍稀干果和木本油料植物,具有重要的經(jīng)濟、社會和生態(tài)價值[7]。由于傳統(tǒng)嫁接繁殖難以滿足目前市場的巨大需求,近年來,研究人員開展了香榧植株體胚發(fā)生及再生體系的建立等研究[8-11]。但由于缺乏對香榧種子內(nèi)幼胚發(fā)育過程及體胚誘導及發(fā)生規(guī)律的深入了解,導致其體胚發(fā)生及再生體系難以穩(wěn)定,有效繁殖系數(shù)低。本研究以不同發(fā)育階段的香榧幼胚為外植體,開展胚性愈傷組織及體細胞胚誘導研究,通過對不同發(fā)育時期來源的幼胚進行誘導率分析,同時輔以幼胚內(nèi)源激素的變化規(guī)律,擬闡明香榧幼胚發(fā)育狀態(tài)與其胚性感受態(tài)之間的相關(guān)性,為建立香榧穩(wěn)定、高效體胚發(fā)生及植株再生體系提供良好的技術(shù)平臺,同時也為后期香榧遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立打下良好的基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    于2014年7月5日至8月23日,選取浙江農(nóng)林大學試驗基地中良好的香榧植株(圖1A)。香榧種子于5月10日突破種鱗,以此日期為起點計算,即種子突破種鱗后第8周至第15周(以下簡稱第8周至第15周),分8次采集發(fā)育正常、大小適中的種子帶回實驗室待處理。

    1.2 實驗方法

    將8次采集的香榧種子用解剖刀去除香榧種子的假種皮,放入添加洗滌劑的清水中搓洗數(shù)次并漂洗干凈,在自來水流水下沖洗1~2 h后用吸水紙將種子表面水分吸干。在超凈工作臺上用體積分數(shù)為75%乙醇表面滅菌處理好的香榧種子3 min,無菌水沖洗3~4次,再用稀釋10倍的次氯酸鈉(NaClO)溶液(每50 mL加1滴吐溫)真空抽濾20 min,無菌水沖洗5~6次,無菌吸水紙吸干種子表面水分后等用。用無菌修枝剪從表面滅菌后的種子頂端(俗稱榧眼端)縱向剪開,在體視顯微鏡(Zeiss Stereo Discovery V12)下用解剖針剝?nèi)⊥暾着撸谩?/p>

    1.2.1 不同發(fā)育時期幼胚內(nèi)源吲哚乙酸(IAA)及脫落酸(ABA)的質(zhì)量分數(shù)測定 將8個不同發(fā)育時期的香榧幼胚(每次剝?nèi)?.2 g左右),立即用液氮速凍,放入-70℃的低溫冰箱內(nèi)以備內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)測定。內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)測定時每0.1 g樣品加入1 mL內(nèi)含1 mmol·L-1二叔丁基對甲苯酚的80%甲醇提取液,弱光下冰浴研磨冰凍鮮樣成勻漿,轉(zhuǎn)入離心管中,再用1 mL提取液分次沖洗研缽,一并轉(zhuǎn)入離心管中。4℃下提取4 h,1 000g離心15 min取上清液,殘渣加入1 mL提取液4℃下提取1 h,合并上清液。上清液過18C固相萃取柱后,用氮氣吹干。過柱后的樣品用pH 7.4的磷酸緩沖液溶解后,將樣品甲脂化,即用氮氣吹干,之后再用甲醇溶解,在冰浴條件下加過量的重氮甲烷反應至黃色,10 min后加半滴0.2 mol·L-1乙酸甲醇破壞過量的重氮甲烷(黃色消失),用氮氣吹干,磷酸緩沖液溶解后進行酶聯(lián)吸附法(ELSA)測定ABA和IAA質(zhì)量分數(shù)(分母為幼胚鮮質(zhì)量)。每個處理重復3次。

    圖1 香榧種子及幼胚生物學特性Figure 1 Characters of seeds and immature embryos of Torreya grandis ‘Merrillii’

    1.2.2 香榧胚性愈傷組織及體胚誘導 將8個不同發(fā)育時期的香榧幼胚取出后,接種在胚性愈傷組織及體胚誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基成分如下:①以1/2 SH為基本培養(yǎng)基[12],附加0.1 mg·L-1萘乙酸(NAA),2 g·L-1活性碳, 30 g·L-1蔗糖; ②1/2 SH 基本培養(yǎng)基, 附加 0.1 mg·L-1NAA, 0.5 g·L-1谷氨酰胺, 2 g·L-1活性碳,30 g·L-1蔗糖;③1/2 SH基本培養(yǎng)基(對照)。培養(yǎng)基附加4 g·L-1瓊脂,pH 5.7,暗培養(yǎng)。每處理接種20個幼胚,重復3次。

    1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每天觀察幼胚生長情況,當幼胚暗培養(yǎng)4周時,在體視顯微鏡下觀察胚性愈傷組織、體胚誘導以及幼胚萌發(fā)情況,統(tǒng)計各處理下胚性愈傷組織誘導率、體胚發(fā)生率以及幼胚直接萌發(fā)率。實驗數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 8.0和SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析,Duncan新復極差檢驗法進行多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 香榧幼胚發(fā)育的形態(tài)特征觀察

    觀察發(fā)現(xiàn),成熟的香榧種子具假種皮,綠色纖維質(zhì)(圖1A)。剝?nèi)ゼ俜N皮,可見棕褐色外種皮,堅硬木質(zhì)化(圖1B,圖1C箭頭2所示)。內(nèi)種皮暗紅色,褶皺膜質(zhì),內(nèi)陷成脊狀(圖1C,箭頭1所示)。胚乳單倍體,乳白色,為主要可食用部位(圖1C,箭頭3所示)。香榧幼胚位于種子榧眼端雌配子體腔內(nèi),細小不明顯(圖1C,橢圓所示,圖1D),幼胚胚體和胚柄系統(tǒng)相連,胚柄系統(tǒng)靠近珠孔端,胚頭部遠離珠孔端。香榧胚發(fā)育經(jīng)歷多胚時期、胚胎選擇時期和優(yōu)勢胚完全發(fā)育等3個時期。通過胚胎選擇,多個香榧幼胚最后僅有1個發(fā)育較好,其他幼胚在不同發(fā)育階段終止發(fā)育而萎縮。香榧早期幼胚為棒狀(圖1E,F),隨著幼胚發(fā)育成熟,頭部逐漸膨大,直至子葉展開,胚柄萎縮脫落(圖1G,H)。

    2.2 不同胚齡對香榧幼胚內(nèi)源ABA及IAA質(zhì)量分數(shù)的影響

    不同發(fā)育時期香榧幼胚的內(nèi)源IAA及ABA質(zhì)量分數(shù)具顯著性差異(P<0.05)。香榧幼胚內(nèi)源IAA的質(zhì)量分數(shù)在胚珠突破種鱗后第8周處于最大值,達53.90 ng·g-1,第9周稍有下降,但與第8周之間無顯著性差異,之后迅速下降至44.14 ng·g-1。隨著胚齡的逐漸增加,內(nèi)源IAA質(zhì)量分數(shù)總體呈小幅波動的下降趨勢,第 15周最低,為 35.60 ng·g-1(圖 2)。

    香榧幼胚內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果表明:幼胚胚齡對其內(nèi)源ABA的質(zhì)量分數(shù)同樣具有顯著影響(P<0.05)。在種鱗突破種皮后的第8至第15周內(nèi),隨著胚齡的增加,內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)呈先下降后上升的總趨勢,其中第8周至第10周,內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)先下降后上升,但變化幅度比較小;第10周到第12周處于快速上升期,從第10周的89.80 ng·g-1上升到第12周的144.67 ng·g-1;第13至15周內(nèi)源ABA處于變化平緩期,且維持在較高水平,其中第14周和第15周內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)無顯著差異,第15周達到最大值,為160.20 ng·g-1(圖2)。

    2.3 不同胚齡對香榧幼胚胚性感受態(tài)的影響

    不同發(fā)育階段香榧幼胚的胚性感受態(tài)具顯著差異;同時,不同離體培養(yǎng)條件對香榧幼胚的胚性感受態(tài)激發(fā)也有顯著差異(表1,圖3,圖4)。將香榧幼胚接種于1/2 SH基本培養(yǎng)基中培養(yǎng),當幼胚胚齡較小時,可產(chǎn)生極少量胚性愈傷組織,但從第10周開始,胚性愈傷組織誘導率均為0,但各胚齡幼胚均未誘導直接產(chǎn)生體胚。將幼胚接種于附加0.1 mg·L-1NAA的1/2 SH基本培養(yǎng)基上培養(yǎng),隨著幼胚胚齡的增加,胚性愈傷組織誘導率先上升后下降,其中第8周幼胚的胚性愈傷組織誘導率為48.1%,第9周時略有升高,達到最高值,為48.3%,隨后逐漸下降,第14至第15周胚性愈傷組織誘導率為0;將香榧幼胚置于1/2 SH基本培養(yǎng)基附加0.1 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng),隨著胚齡的增加,誘導率也呈先上升后下降的趨勢,第8周體胚誘導率為0,第9周體胚誘導率上升為5.8%,至第10周體胚誘導率達到最高,為42.7%,后隨著胚齡的增加,體胚誘導率逐漸下降,第14周至第15周體胚誘導率為0(圖3)。

    圖2 香榧幼胚胚齡對其內(nèi)源IAA及ABA質(zhì)量分數(shù)的影響Figure 2 Effectofdevelopmentalstageson endogenous IAA and ABA content of immature embryo in Torreya grandis‘Merrillii’

    表1 胚齡及萘乙酸對香榧幼胚胚性感受態(tài)的影響Table 1 Effect of developmental stages and NAA on embryo genic frequency of Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos

    第8周至第15周的幼胚進行離體萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn),不同外植體發(fā)育階段及培養(yǎng)條件對萌發(fā)率具有顯著影響(圖4)。將幼胚培養(yǎng)于1/2 SH基本培養(yǎng)基中,萌發(fā)率隨著胚齡的增加而升高,第8周至第9周幼胚萌發(fā)率為0,從第10周開始,萌發(fā)率逐漸上升,第14周時達最高值,為65.1%,之后略有下降。而當幼胚培養(yǎng)于附加0.1 mg·L-11/2 SH培養(yǎng)基NAA中進行萌發(fā)培養(yǎng)時,香榧幼胚極易產(chǎn)生愈傷組織而不能正常萌發(fā)形成有效苗(圖5)。

    3 結(jié)論與討論

    圖3 胚齡對胚性愈傷組織及體胚直接發(fā)生的影響Figure 3 Effect of immature embryo developmental stages on embryogenic callus induction and direct somatic embryogenesis (SH+0.1 mg·L-1NAA)

    圖4 胚齡及培養(yǎng)條件對香榧幼胚萌發(fā)的影響Figure 4 Effect of immature embryo developmental stages and media on in vitro germination

    圖5 不同胚齡對香榧幼胚胚性感受態(tài)的影響Figure 5 Embryogenic frequency of immature embryos under different developmental stages

    體細胞胚胎發(fā)生在植物組織培養(yǎng)過程中,外植體材料的基因型、發(fā)育階段以及生理狀態(tài)等決定了其胚性感受態(tài)的強弱。對于多數(shù)植物來說,特定階段幼胚的胚性感受態(tài)明顯強于其他階段[13]。目前,已有多種裸子植物經(jīng)誘導成功獲得了體細胞胚[14]。與被子植物不同,裸子植物體細胞胚誘導對外植體的要求更加嚴格,一般情況下,以胚性感受態(tài)較高的幼胚為外植體進行體胚誘導。如,在火炬松Pinus taeda,華北落葉松Larix principis-rupprechtii等針葉樹,需采用各發(fā)育階段的幼胚為外植體進行體胚誘導[15-19]。除此以外,部分研究還采用了未成熟的雌配子體為外植體成功獲得了體細胞胚[20-22]。本研究采用香榧胚珠突破種鱗后第8~15周的幼胚為外植體,第9周幼胚胚性愈傷組織誘導率最高,達54.3%,第11周幼胚的體胚直接發(fā)生率最高,達48.4%,表明不同發(fā)育時期對香榧幼胚胚性感受態(tài)具顯著影響。然而,盡管幼胚在某些階段(如子葉胚早期、子葉胚晚期等)具有良好的胚性感受態(tài),但對于絕大多數(shù)植物來說,植物組織由于幼胚胚性感受態(tài)表現(xiàn)出的細胞全能性仍需要合適的條件下才能受到激發(fā)。本研究中將香榧幼胚培養(yǎng)于附加0.1 mg·L-1NAA的SH基本培養(yǎng)基時,無論是胚性愈傷組織誘導率還是體細胞胚直接發(fā)生率,都顯著高于在SH基本培養(yǎng)基中的誘導結(jié)果,說明香榧幼胚胚性感受態(tài)也需要特定條件(外源NAA)激發(fā)。

    幼胚胚性感受態(tài)需在特定條件下才能被激活的現(xiàn)象與植物幼胚體的生理狀態(tài)密切相關(guān)[18,23]。植物的內(nèi)源激素是影響組織胚性感受態(tài)的最重要因素之一。以香雪蘭Freesia refracta花序為外植體進行體細胞胚誘導,花序的形態(tài)學上端無體細胞形成,而下端可分化出體細胞胚。檢測結(jié)果表明,體細胞胚誘導前的花序形態(tài)學上下兩端內(nèi)源IAA質(zhì)量分數(shù)無明顯差別,但培養(yǎng)后形態(tài)學下端(體細胞胚發(fā)生端)IAA質(zhì)量分數(shù)明顯高于上端,表明內(nèi)源IAA質(zhì)量分數(shù)是香雪蘭花序誘導產(chǎn)生體細胞胚的主導因子之一[24]。本研究第8周至第11周幼胚的內(nèi)源IAA質(zhì)量分數(shù)較高,此時極易誘導胚性愈傷組織或體細胞胚,說明高質(zhì)量分數(shù)內(nèi)源IAA可能提高幼胚的胚性感受態(tài),使幼胚易于受外源激素誘導并脫分化?,F(xiàn)有研究表明,ABA對于植物胚的正常發(fā)育和防止早萌具有重要作用[25]。不僅如此,ABA對胚發(fā)育調(diào)節(jié)作用與胚的發(fā)育程度有關(guān),果針入土后10 d的花生幼胚,在無外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中能夠正常發(fā)育,而果針入土后20 d的花生幼胚需要越來越高的外源ABA維持才能正常發(fā)育[26]。本研究中香榧幼胚第8~11周幼胚內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)較低,此時幼胚的胚性感受態(tài)較高,隨著胚齡增加,ABA質(zhì)量分數(shù)快速上升并維持在較高水平,但幼胚胚性感受態(tài)逐漸降低,可能與ABA可以促進香榧胚胎發(fā)育成熟有關(guān),此現(xiàn)象與一定質(zhì)量分數(shù)ABA促進華北落葉松、云杉Picea等裸子植物體胚成熟相似[19,27]。

    綜上所述,香榧第8~12周幼胚具有較高的胚性感受態(tài),同時,通過對幼胚內(nèi)源激素的測定,對維持外植體高胚性感受態(tài),開展香榧胚性愈傷組織及體胚發(fā)生培養(yǎng)條件的篩選提供了技術(shù)指導。香榧幼胚發(fā)育狀態(tài)與胚性感受態(tài)之間的相關(guān)性是以幼胚為外植體進行胚性愈傷組織及體細胞胚的重要環(huán)節(jié)。由此掌握精確幼胚取樣時間,準確采樣,極大縮短體細胞胚誘導及培養(yǎng)的周期,大大降低培養(yǎng)成本,可為香榧遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供良好的技術(shù)平臺。

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