紫草素對HGF誘導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)作用

沈 東， 王 維

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院藥學(xué)部， 浙江 杭州 310018； 2杭州市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部， 浙江 杭州 310009)

近年來隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，我國肺癌患者的死亡率呈逐年上升趨勢，并且低齡化趨勢也越來越明顯，統(tǒng)計(jì)顯示肺癌發(fā)病率和死亡率均居于10大惡性腫瘤的首位[1]。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肺癌治療中最為棘手的問題，而上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe-lial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[2]。目前研究報(bào)道證實(shí)，EMT在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和肝癌等多種腫瘤的原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，且EMT的程度與細(xì)胞侵襲和遷移能力呈正相關(guān)[3]。因此，研究EMT的發(fā)生，對于尋找治療腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的目標(biāo)靶點(diǎn)有重要意義。

紫草素(shikonin)是草本植物紫草根部提取的一種萘醌類單體化合物，具有抗癌、抗菌、抗炎和促進(jìn)傷口愈合等多種藥理作用[4]。近年來，紫草素的抗腫瘤作用引起人們的廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道的紫草素抗腫瘤作用主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。然而，紫草素是否可通過抑制腫瘤細(xì)胞的EMT發(fā)揮抗腫瘤作用，目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討紫草素對肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)誘導(dǎo)的肺癌PC9細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用及對細(xì)胞侵襲和遷移的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。紫草素、肝細(xì)胞生長因子和DMSO購自Sigma；胎牛血清購自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司； MTT 和RIPA細(xì)胞裂解液購自碧云天生物公司；抗上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo；ECL超敏發(fā)光液購自Millipore。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌PC9細(xì)胞用含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%之后，每3 d 用0．25%胰蛋白酶消化傳代并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期細(xì)胞以5.0×107/L的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(0.5、1、2、4和8 μmol/L)shikonin，以DMSO溶劑組為對照組。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。最后，吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。每個(gè)濃度設(shè)平行重復(fù)6孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.3劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將PC9細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪滿孔底，用10 μL槍頭小心在孔底劃痕，PBS清洗3次，加入含有2.5%低血清的新鮮培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下拍照，沿劃痕邊緣等間距取3處測量劃痕寬度，取平均值。然后加入HGF(50 μg/L)或HGF(50 μg/L)+shikonin(1 μmol/L)作用，24 h后繼續(xù)拍照，在相同觀察點(diǎn)測量劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.4Transwell小室實(shí)驗(yàn) 將HGF誘導(dǎo)前后的細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基制成8×107/L細(xì)胞懸液，在Transwell小室的上室中加入含有HGF(50 μg/L)或HGF(50 μg/L)+shikonin(1 μmol/L)的細(xì)胞懸液200 μL，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，吸棄小室內(nèi)液體，用棉簽輕輕擦去基質(zhì)膠和上室未穿膜細(xì)胞，PBS漂洗后，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，再用PBS漂洗后，倒置顯微鏡下觀察拍照，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目，取平均值。

2.5細(xì)胞形態(tài)的觀察 取對數(shù)生長期的肺癌PC9細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為對照(control)組、HGF(50 μg/L)組、HGF(50 μg/L)+shikonin (1 μmol/L)組和HGF(50 μg/L)+shikonin(2 μmol/L)組，作用24 h后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并照相。

2.6Western blot法檢測EMT相關(guān)蛋白水平變化 采用50 μg/L的HGF作用肺癌PC9細(xì)胞24 h，然后加入shikonin(1 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，各組細(xì)胞用RIPA裂解液裂解提取各組細(xì)胞的總蛋白，用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度定量。每個(gè)泳道蛋白樣品10 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，利用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用現(xiàn)配的脫脂牛奶溫室封閉1 h后，分別加入抗E-cadherin、N-cadherin、vimentin和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入對應(yīng)II 抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次 每次5min, ECL加入電化學(xué)發(fā)光法發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析條帶灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 紫草素抑制肺癌PC9細(xì)胞的活力

MTT法檢測shikonin對PC9細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，隨著給藥劑量的增加，shikonin對肺癌PC9細(xì)胞的生長抑制率顯著上升(P<0.01)，見圖1。在給藥24 h后，shikonin的IC50為9.364 μmol/L。

Figure 1. The effects of shikonin on the viability of PC9 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖1不同濃度的紫草素對肺癌PC9細(xì)胞活力的影響

2 紫草素抑制HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，HGF可誘導(dǎo)PC9細(xì)胞遷移(P<0.01)；在HGF存在的條件下，用shikonin處后，HGF對PC9細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用減弱，與HGF作用組相比，在用shikonin作用24 h后，劃痕愈合率呈現(xiàn)明顯降低(P<0.01),說明shikonin可明顯抑制由HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞遷移，見圖2。

3 紫草素抑制 HGF 誘導(dǎo)的 PC9細(xì)胞侵襲

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HGF作用組穿透細(xì)胞的數(shù)量要比未經(jīng)HGF作用組處理的細(xì)胞明顯增多(P<0.01)；而加入shikonin(1 μmol/L)作用肺癌PC9細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲能力明顯下降(P<0.01),表明shikonin可明顯抑制由HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞侵襲，見圖3。

4 紫草素對肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響

與對照組細(xì)胞形態(tài)比較，加入50 μg/L HGF刺激后，PC9細(xì)胞形態(tài)失去了上皮細(xì)胞所特有的多邊、排列較為規(guī)則、緊密的形態(tài)，變成了更為細(xì)長的形態(tài)；然而，加入shikonin作用后則逐漸逆轉(zhuǎn)了這一變化,見圖4。

Figure 2. The effect of shikonin on migration of PC9 cells. The cell migration ability was examined by wound healing assay. The scale bar=200 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHGF group.

圖2劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測紫草素對肺癌PC9細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 3. The effect of shikonin on invasion ability of PC9 cells. The cell invasion ability was examined by Transwell assay. The sale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHGF group.

圖3Transwell小室法檢測紫草素對肺癌PC9細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 4. The morphological changes of PC9 cells after HGF and shikonin treatment (×200).

圖4HGF和紫草素處理前后細(xì)胞形態(tài)的變化

5 紫草素逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞EMT

用Western blot 檢測shikonin對EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin的影響，發(fā)現(xiàn)HGF可顯著下調(diào)PC9細(xì)胞E-cadherin 的蛋白表達(dá)，而上調(diào)N-cadherin和vimentin的蛋白表達(dá)(P<0.01)，加入shikonin(1 μmol/L)作用后則可逆轉(zhuǎn)由HGF 誘導(dǎo)的PC9 細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)下調(diào)和N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，見圖5。

討 論

肺癌是當(dāng)今全球危害性最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因[2]。盡管治療腫瘤的方法不斷發(fā)展與更新，新的抗腫瘤藥物也是層出不窮，但肺癌患者長期生存率并沒有明顯提高。因此，尋找一種抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的新方法和策略已成為醫(yī)藥界的一個(gè)重要課題。

Figure 5. The protein levels of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in HGF-induced PC9 cells treated with shikonin. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHGF group.

圖5紫草素對HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和vimentin表達(dá)水平的影響

EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。典型的EMT是指上皮細(xì)胞失去上皮特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的一種生物現(xiàn)象，表現(xiàn)為遷移及侵襲能力增強(qiáng)、細(xì)胞播散能力增強(qiáng)、細(xì)胞形態(tài)延伸以及抗調(diào)亡能力增強(qiáng)。E-cadherin用于維持正常上皮細(xì)胞間的穩(wěn)定性，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，是EMT的關(guān)鍵分子；間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin則具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移的作用。EMT的發(fā)生可受環(huán)境刺激或胞外基質(zhì)因子調(diào)節(jié)[6]。HGF是肝細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，在一些腫瘤模型中[7]，HGF可誘導(dǎo)EMT，從而降低腫瘤細(xì)胞間的黏附并增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力。如詹建偉等[8]報(bào)道姜黃素逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)PC9細(xì)胞對吉非替尼的耐藥中HGF可誘導(dǎo)肺癌發(fā)生EMT；莫翠菊等[9]報(bào)道HGF可誘導(dǎo)肝癌Huh7細(xì)胞發(fā)生EMT。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過HGF誘導(dǎo)，成功建立了肺癌PC9細(xì)胞EMT模型，加入HGF 刺激后，PC9細(xì)胞形態(tài)變得更為細(xì)長，且細(xì)胞遷移侵和襲能力比誘導(dǎo)前明顯增強(qiáng)；上皮細(xì)胞的E-cadherin標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)。

紫草素是從我國傳統(tǒng)中藥紫草根部提取出來的萘醌色素，具有抗炎、抑制脂肪形成、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等廣泛的藥理作用及生物學(xué)效應(yīng)[5]，其中抗腫瘤作用是目前研究的熱點(diǎn)。紫草素類化合物的抗腫瘤機(jī)制涉及多個(gè)靶點(diǎn)，文獻(xiàn)報(bào)道的紫草素類化合物的抗腫瘤作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]、抑制蛋白酪氨酸激酶[11]、抗腫瘤血管生成[12]及影響腫瘤細(xì)胞信號傳遞[13]等。本文將在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)闡述紫草素對HGF誘導(dǎo)肺癌PC9細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響。

綜上所述，我們觀察到HGF誘導(dǎo)使肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的形態(tài)變化，并通過EMT標(biāo)志性蛋白分子進(jìn)一步證明了EMT的發(fā)生。在加入紫草素干預(yù)后，細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯降低；同時(shí)檢測EMT標(biāo)志性蛋白分子的變化，細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)相對于EMT模型明顯上調(diào)，N-cadherin和vimentin 蛋白表達(dá)則明顯下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)初步研究表明紫草素作為一種天然存在的化合物能明顯能逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的肺癌PC9細(xì)胞EMT，為紫草素應(yīng)用于肺癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。