丙戊酸鈉對AML1-ETO轉染細胞中CEBPA基因表達及表觀遺傳修飾的影響*

莊文越， 李正祎， 劉 燕， 夏 薇△， 陳子興

(1北華大學醫(yī)學檢驗學院， 2吉林醫(yī)藥學院檢驗學院， 吉林 吉林 132013； 3蘇州大學附屬第一醫(yī)院， 江蘇省血液學研究所， 江蘇 蘇州 215000)

近年來，丙戊酸鈉(sodium valproate，VPA)被發(fā)現具有抑制組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)活性的作用，屬于HDAC抑制劑(HDAC inhibitor，HDACI)的短鏈脂肪酸類，可通過抑制HDAC的作用，使核小體組蛋白乙?；孓DHDAC參與的異?；虮磉_，從而引起廣泛的抗腫瘤效應，包括誘導腫瘤細胞分化、阻滯細胞周期和促進腫瘤細胞凋亡、增強機體對化療和放療的敏感性及逆轉轉移性腫瘤的惡性表型等[1-2]。為研究AML1-ETO融合蛋白的致白血病機理，我們前期將AML1-ETO融合基因穩(wěn)定轉入白血病細胞株U937中，并以染色質免疫共沉淀技術(chromatin immunoprecipitation，ChIP)等技術已確認CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α,CEBPA)基因是AML1-ETO融合蛋白結合的直接調控轉錄的下游基因之一。AML1-ETO融合蛋白通過修飾組蛋白的乙?；图谆笴EBPA基因沉默，從而改變了U937-A/E細胞的增殖分化表型[3]。本研究以急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)U937-A/E細胞株為模型，研究VPA對AML1-ETO轉染細胞中CEBPA基因表觀遺傳修飾的調控，探討VPA誘導沉默的CEBPA基因再表達的可能機制，為表觀遺傳學調控治療腫瘤提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

蛋白酶抑制劑混合物、RNase、VPA、蛋白酶K和CCK-8試劑盒均購自Sigma；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Thermo Scientific；ChIP kit及抗乙?；M蛋白H3(acetylated histone H3, AcH3)和AcH4 抗體均購自Millipore。

2 細胞培養(yǎng)和藥物處理

將本室構建的穩(wěn)定轉染了重組質粒pcDNA3.1-AML1-ETO的亞克隆細胞株命名為U937-A/E1～4，設為實驗組；將轉染了空質粒pcDNA3.1(-)的U937細胞命名為U937-Mock，設為空載體組；U937-WT細胞由本實驗室保存，為無質粒轉染的野生型U937細胞，設為空白對照組。細胞以5×106/L的密度接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液傳代。實驗采用對數生長期的細胞，用不同濃度(0.1、0.5、1.0和2.0 mmol/L)的VPA分別處理細胞24 h、48 h和72 h，以不加藥物組作為對照組，收集細胞并洗滌，進行相關檢測。

3 主要方法

3.1CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長期細胞，接種單細胞懸液于96孔板，每孔100 μL(含8 000個細胞)，每組設3個復孔，不同處理時間后，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后在450 nm波長下，酶聯(lián)免疫分析儀測定各孔吸光度(A)，按照公式計算細胞生長抑制率。細胞抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。以抑制率為縱坐標，以藥物濃度(mmol/L)為橫坐標，繪制生長曲線。

3.2臺盼藍染色活細胞計數實驗 將培養(yǎng)至對數生長期的細胞以每孔4×105個接種于6孔板，給予不同濃度VPA(0.1、0.5、1.0和2.0 mmol/L)作用不同時間(24 h、48 h和72 h)，用濃度為0.1%的臺盼藍染色，3 min內用計數板分別計數活細胞和死細胞。鏡下觀察，死細胞被染成藍色， 而活細胞拒染。

3.3流式細胞術檢測細胞表面抗原 取對數生長期的U937-WT、U937-Mock和U937-A/E1～4細胞2×105個，每次每組設2孔，相同條件下重復3次，加PE-CD11b和FITC-CD14單抗，4 ℃培育30 min，PBS洗滌2次，用200 μL PBS混懸。用FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)檢測，CellQuest軟件(Becton Dickinson)分析結果。

3.4RT-qPCR檢測藥物處理前后CEBPA mRNA的表達變化 首先應用Invitrogen的M-MLV反轉錄試劑盒進行cDNA合成。用SYBR Green染料法在ABI 7500型熒光實時定量PCR儀上進行qPCR擴增反應。CEBPA的上游引物序列為5’-CTTCAACGACGAGTTCCTGGCCGA-3’；下游引物序列為5’-AGCTGCTTGGCTTCATCCTCCT-3’。β-actin的上游引物序列為5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3’,下游引物序列為5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。根據2-ΔΔCt法計算CEBPA的 mRNA相對表達量。

3.5ChIP-qPCR方法檢測藥物處理前后CEBPA基因組蛋白H3和H4的乙酰化狀態(tài) 收集1×108細胞加入終濃度體積分數為1%的甲醛溶液，室溫搖床孵育10 min，加入1/20體積的2.5 mol/L的甘氨酸，室溫搖床孵育5 min后，4 ℃、400×g離心5 min，收集細胞用1×PBS洗2遍，細胞碎片用ChIP lysis buffer (Affymetrix)重懸，超聲得到染色體平均大小為500 bp，利用抗AcH3和抗AcH4 抗體，按照Millipore的ChIP具體步驟操作。ChIP沉淀富集的樣本，以CEBPA基因啟動子區(qū)設計的引物進行PCR擴增，引物如下：上游引物5’-TGGACAAGAACAGCAACGAG-3’，下游引物5’-TTGTCACTGGTCAGCTCCAG-3’。ChIP沉淀富集的DNA用SYBR Green染料方法進行real-time PCR分析。有效數據的判斷：(1)各樣品的擴增曲線須達到平臺期；(2)熔解曲線為單一的峰，并且熔解溫度在75 ℃以上才能提示該擴增為特異性擴增。ChIP-qPCR的結果按%Input=2-ΔCt(normalized ChIP)公式處理數據，其中ΔCt(normalized ChIP)=Ct(ChIP)-[Ct(Input)-log2(Input Dilution Factor)]，Input Dilution Factor= (fraction of the input chromatin saved)-1。

4 統(tǒng)計學處理

所有的實驗重復3次，運用SPSS 22.0 軟件對實驗結果進行分析。定量資料結果以均數±標準差(mean±SD)表示，兩獨立樣本之間均數比較采用t檢驗，多組樣本之間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 VPA對U937及AML1-ETO轉染細胞增殖的影響

CCK-8法結果表明，1.0 mmol/L及以上濃度的VPA在不同時點檢測的細胞抑制率均有顯著差異(P<0.05)；在同一時點，不同濃度下的細胞抑制率之間有明顯差異(P<0.05)，隨著濃度的增加，VPA的增殖抑制效應逐漸增強，呈現劑量和時間依賴性，見圖1A。在活細胞計數實驗中, 實驗組細胞的增殖情況與對照組相比明顯受到抑制, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B。后續(xù)的實驗中以VPA 1.0 mmol/L為藥物濃度組、48 h為作用時間進行分析。

Figure 1. The effect of VPA on the proliferation of U937 andAML1-ETOtransfected cells. A: the cell viability was measured by CCK-8 assay; B: the living cell numbers were counted by the method of Trypan blue exclusion. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0.1 mmol/L group;*P<0.05vs0 mmol/L group.

圖1VPA對U937及AML1-ETO轉染細胞增殖的影響

2 VPA誘導細胞髓系分化抗原的表達改變

CD11b和CD14是髓系標志，表達于較成熟的粒細胞和單核細胞。上述各組細胞經1.0 mmol/L VPA培養(yǎng)48 h后，亞克隆細胞株間的CD11b和CD14表達陽性率相互比較，顯示AML1-ETO轉染細胞株U937-A/E1～4的CD11b和CD14表達陽性率均顯著低于U937-Mock和U937-WT細胞(P<0.05)，這與藥物處理前的分化抗原表達下降趨勢是一致的。同時，藥物處理后，與對照未加藥組比較，CD11b和CD14的表達均明顯升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effect of VPA on the expression of CD11b and CD14 in the U937 andAML1-ETOtransfected cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsVPA-untreated group;△P<0.05vsU937-Mock or U937-WT.

圖2VPA對U937及AML1-ETO轉染細胞CD11b和CD14表達的影響

3 VPA對CEBPA mRNA表達水平的影響

采用RT-qPCR檢測處理組和對照組細胞中CEBPA mRNA的表達水平。結果顯示，經1.0 mmol/L VPA作用48 h后U937-A/E1～4各細胞株中，與對照組比較，VPA均明顯上調CEBPA mRNA的表達水平(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The effect of VPA on mRNA expression of CEBPA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3VPA對CEBPAmRNA表達水平的影響

4 VPA作用前后CEBPA基因啟動子表觀遺傳修飾的檢測結果

用VPA處理細胞后，與藥物處理前比較，CEBPA基因啟動子區(qū)核染色質的組蛋白H3和H4乙?；缴?P<0.05)； 同時，VPA處理細胞后，各細胞株間比較發(fā)現，AML1-ETO轉染細胞U937-A/E1～4的CEBPA啟動子區(qū)所在染色質的H3及H4乙酰化水平均顯著低于U937-Mock及U937-WT細胞(P<0.05)，這些表觀遺傳學修飾的特征與藥物處理前是一致的，見圖4。

Figure 4. The effect of VPA on H3 and H4 acetylation ofCEBPAgene. A: H3 acetylation ofCEBPAgene; B: H4 acetylation ofCEBPAgene. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsVPA-untreated group;△P<0.05vsU937-Mock or U937-WT.

圖4VPA對CEBPA基因組蛋白H3和H4乙?；降挠绊?/p>

討 論

表觀遺傳修飾中組蛋白的乙酰化和去乙?；揎椩谡婧思毎蜣D錄調控中發(fā)揮重要作用，而組蛋白乙?；且粋€可逆的動態(tài)過程，由組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases,HATs)和HDACs這一對酶的相互平衡進行調節(jié)。組蛋白的乙酰化和去乙?；蔀樘囟ɑ虮磉_的切換開關[4]，它們的功能紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子機制。腫瘤細胞中HDACs異?；罨蓪е乱幌盗谢虻霓D錄受抑，所涉及的有與增殖調節(jié)、遷移、血管發(fā)生、細胞分化、侵襲和轉移等相關基因[5]。VPA作為一種廣泛應用于臨床的廣譜抗癲癇藥物，是一種HDAC抑制劑，多項體外研究顯示其可誘導多種腫瘤細胞分化與凋亡、導致細胞周期阻滯而抑制多種腫瘤細胞增殖[6-8]。本實驗結果表明，用CCK-8法觀察VPA對U937細胞增殖狀態(tài)的影響, 在一定濃度范圍內VPA隨著濃度的增加和作用時間的延長,抑制作用逐漸增強，呈劑量和時間依賴性，說明VPA可以抑制U937及其轉染細胞的增殖。VPA在1.0 mmol/L分別作用48 h后可以誘導白血病細胞U937及其轉染了AML1-ETO的細胞發(fā)生分化。

在急性髓性白血病中，由于染色體易位t(8;21)和基因重排產生了新的融合基因AML1-ETO，其蛋白產物通過募集HDAC，使在造血細胞增殖、分化和凋亡過程中起重要作用的基因表達受到抑制，導致白血病的發(fā)生[9]。研究發(fā)現，VPA能特異性誘導AML1-ETO陽性細胞系(Kasumi-1和Kasumi-6)分化，繼而誘導凋亡并上調AML1目的基因的表達，但在AML1-ETO陰性細胞系MV4-11和K562未觀察到上述變化[10]。Insinga等[11]研究證明，VPA能提高AML1-ETO、PML-RARα陽性AML患者及小鼠骨髓原始細胞組蛋白乙?；?，通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體及Fas死亡受體途徑誘導凋亡。C/EBPα蛋白是造血系統(tǒng)中調控髓系分化的重要轉錄因子，在造血分化早期階段對造血干祖細胞分化命運的選擇起決定作用。本研究前期實驗發(fā)現，AML1-ETO轉染各細胞株中，CEBPA mRNA普遍處于低表達狀態(tài)，使分化阻滯，導致白血病的發(fā)生[3]。在此基礎上，本研究深入探討VPA作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑對AML1-ETO陽性細胞中CEBPA基因表達及表觀遺傳修飾的影響，結果發(fā)現使用VPA可明顯上調CEBPA mRNA的表達水平，VPA處理組U937及AML1-ETO轉染細胞株CEBPA啟動子區(qū)的組蛋白H3和H4的乙?；缴?。由此證明，VPA能夠在一定程度上使M2b型白血病細胞因染色質組蛋白低乙酰化而轉錄失活的CEBPA基因恢復其轉錄活性，CEBPA mRNA得以重新表達，從而能夠發(fā)揮抗凋亡、促分化和腫瘤抑制的作用。

綜上所述，HDAC抑制劑VPA對U937及其AML1-ETO轉染細胞均有生長抑制和促分化的作用，并且通過提高CEBPA基因的組蛋白乙?；绞乖臼芤值腃EBPA基因在M2b型白血病細胞中重新表達或表達增加，通過人為的干預拮抗，甚至逆轉異常的表觀遺傳學改變，誘導因表觀遺傳學改變而失活的基因重新表達。這一機理提供了表觀遺傳學調控治療腫瘤的理論基礎，為白血病的基因靶向治療開辟了新的途徑。