黃芩苷通過(guò)影響miR-141上調(diào)Sirt1表達(dá)而抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡*

吳 軍， 夏瑗瑜， 陳 杰， 肖 玲， 王 優(yōu)， 趙媛媛， 葉 剛， 尹青橋△

(武漢第三醫(yī)院 1內(nèi)分泌科， 2腎內(nèi)科， 湖北 武漢 430000)

糖尿病是以胰島素分泌或活性障礙引起的持續(xù)性高血糖為特征的一種代謝失調(diào)性慢性疾病，并伴有多個(gè)器官的功能異常的并發(fā)癥，其中糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為其最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一[1]。血液中長(zhǎng)期高糖(high glucose，HG)環(huán)境可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡，造成的系膜細(xì)胞的缺失是糖尿病導(dǎo)致腎損傷的主要病理機(jī)制[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)黃芩中一種黃酮類有效成分黃芩苷(baicalin)具有良好的腎臟保護(hù)作用，且在治療DN中發(fā)揮重要作用[3]，然而，黃芩苷治療DN的作用機(jī)制尚未完全闡明。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，Sirt1)為第3類組蛋白脫乙酰酶，在許多高糖相關(guān)炎癥性疾病中是一種關(guān)鍵的調(diào)控因子。近年來(lái)研究表明，Sirt1可以通過(guò)調(diào)節(jié)高糖環(huán)境下腎臟細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制腎臟細(xì)胞凋亡和腎臟炎癥反應(yīng)，從而緩解糖尿病腎病的發(fā)展[4]。微小RNA(micro-RNA，miRNA，miR)是一種非編碼小RNA分子，在多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞分化、增殖和凋亡等[5]。此外，miRNA被廣泛認(rèn)為對(duì)多種疾病具有調(diào)控作用，包括糖尿病腎病。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件(microRNA.org)預(yù)測(cè)Sirt1存在的miRNA，得到Sirt1的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)含有miR-141的結(jié)合位點(diǎn)。因此，本研究擬通過(guò)研究黃芩苷對(duì)高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)miR-141及其靶基因Sirt1的表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡的影響，深入闡釋黃芩苷對(duì)糖尿病引發(fā)的腎病的治療機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠腎小球系膜細(xì)胞系SV40-MES-13購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen；miR-141 mimic(用于過(guò)表達(dá)miR-141)、miR-141 inhibitor(用于抑制miR-141表達(dá))、si-Sirt1(用于抑制Sirt1表達(dá))、pcDNA-Sirt1(用于過(guò)表達(dá)Sirt1)以及各自對(duì)照物均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司； RNeasy試劑盒購(gòu)自Qiagen； Reverse Transcription System Kit購(gòu)自TaKaRa；mirVanaTMRT-qPCR miRNA Detection Kit購(gòu)自Ambion； BCA蛋白分析試劑盒和細(xì)胞溶解緩沖液購(gòu)自Beyotime。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 小鼠腎小球系膜細(xì)胞系SV40-MES-13接種于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū)，將miR-141 mimic、miR-141 inhibitor、si-Sirt1、pcDNA-Sirt1以及各自對(duì)照物轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組如下：正常對(duì)照(control)組：培養(yǎng)基中加入5.5 mmol/L葡萄糖；HG組：培養(yǎng)基中加入25 mmol/L葡萄糖；黃芩苷組：培養(yǎng)基中加入100 μmol/L黃芩苷以及5.5 mmol/L葡萄糖；HG+黃芩苷組：培養(yǎng)基中加入100 μmol/L黃芩苷以及25 mmol/L葡萄糖。

2.2miR-141表達(dá)水平的檢測(cè) 采用qPCR檢測(cè)miR-141表達(dá)水平，RNeasy試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，利用Reverse Transcription System Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在ABI 7500 PRISM 7500檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)里，以cDNA為模板，利用mirVanaTMqRT-PCR miRNA Detection Kit進(jìn)行qPCR檢測(cè)miR-141表達(dá)水平。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min; 95 ℃變性15 s， 60 ℃退火60 s， 72 ℃延伸30 s， 共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miR-141上游引物序列為5’-GGGCATCTTCCAGTACAGT-3’，下游引物序列為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列為5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3Sirt1蛋白水平的檢測(cè) 將各組細(xì)胞收集后，在細(xì)胞溶解緩沖液中置于冰上孵育30 min。細(xì)胞裂解液經(jīng)過(guò)離心機(jī)12 000 r/min離心5 min，收集上清液用BCA蛋白分析試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取等量的蛋白樣品行10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，后用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入Ⅰ抗(1∶2 000)在4 ℃孵育過(guò)夜。加入Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，采用HRP Developer圖像軟件顯影，利用Laserdensitometer分析軟件進(jìn)行定量分析。

2.4Sirt1與miR-141調(diào)控關(guān)系的分析 雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)Sirt1與miR-141的調(diào)控關(guān)系。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具(http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)預(yù)測(cè)出miR-141與Sirt1存在結(jié)合位點(diǎn)。將Sirt1野生型片段和突變型片段(miR-141與Sirt1的結(jié)合位點(diǎn)已被突變)克隆至pmirGLO雙螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒上，重組報(bào)告質(zhì)粒分別命名為pmirGLO-Sirt1-WT和pmirGLO-Sirt1-MUT。將重組報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-141 inhibitor或miR-141 mimic共轉(zhuǎn)染至SV40-MES-13細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞利用雙螢光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)各組螢光素酶相對(duì)活性，再將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，通過(guò)500～1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。PBS清洗后，加入Annexin V-FITC和PI染液，4 ℃避光染色5 min。在FACSVerse流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來(lái)表示所有結(jié)果。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞miR-141和Sirt1表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，SV40-MES-13細(xì)胞經(jīng)過(guò)高糖處理后，Sirt1蛋白水平明顯下調(diào)，說(shuō)明高糖抑制SV40-MES-13細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Sirt1表達(dá)；相比于25 mmol/L組，黃芩苷與高糖共同處理SV40-MES-13細(xì)胞后Sirt1水平明顯提高(P<0.01),見(jiàn)圖1A。qPCR結(jié)果顯示HG組miR-141的表達(dá)水平顯著高于control組，黃芩苷可以逆轉(zhuǎn)高糖引起的miR-141水平升高(P<0.01),見(jiàn)圖1B。此外，高糖處理引起SV40-MES-13細(xì)胞凋亡水平顯著升高，黃芩苷可大大抑制高糖引起SV40-MES-13細(xì)胞凋亡(P<0.01),見(jiàn)圖1C。黃芩苷單獨(dú)處理SV40-MES-13細(xì)胞并不會(huì)對(duì)Sirt1、miR-141表達(dá)和細(xì)胞凋亡水平產(chǎn)生明顯影響。

Figure 1. The effects of baicalin and high glucose (HG) on mouse glomerular mesangial cells. A: the protein expression of Sirt1 was determined by Western blot; B: miR-141 expression was detected by qPCR; C: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖1黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞miR-141和Sirt1表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

2 敲減miR-141抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡

為了驗(yàn)證miR-141和高糖之間的關(guān)系，我們用不同濃度(5.5和25 mmol/L)的葡萄糖處理SV40-MES-13細(xì)胞, qPCR結(jié)果顯示，HG組miR-141的表達(dá)水平明顯高于control組(P<0.01)，說(shuō)明高糖環(huán)境促進(jìn)miR-141的表達(dá)水平升高; SV40-MES-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-141 inhibitor后經(jīng)過(guò)高糖處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-141水平下調(diào)(P<0.01)可以抑制高糖誘導(dǎo)的SV40-MES-13細(xì)胞凋亡(P<0.01),見(jiàn)圖2。

3 Sirt1是miR-141直接作用的靶基因之一

為了驗(yàn)證Sirt1與miR-141調(diào)控關(guān)系，本研究首先通過(guò)生物信息在線軟件預(yù)測(cè)miR-141在Sirt1 3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3A。雙螢光素酶報(bào)告分析結(jié)果顯示miR-141 inhibitor與重組報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SV40-MES-13細(xì)胞，顯著提高了野生型Sirt1 3’UTR(Sirt1 3’UTR-WT)的活性(P<0.01)，但是對(duì)突變型Sirt1 3’UTR(Sirt1 3’UTR-MUT)活性沒(méi)有產(chǎn)生影響；miR-141 inhibitor轉(zhuǎn)染至SV40-MES-13細(xì)胞后，Sirt1 mRNA和蛋白水平顯著提高(P<0.01),見(jiàn)圖3B。此外，miR-141 mimic與重組報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SV40-MES-13細(xì)胞，顯著抑制了野生型Sirt1 3’UTR的活性，但是對(duì)突變型Sirt1 3’UTR活性沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響;同時(shí)通過(guò)向SV40-MES-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-141 mimic過(guò)表達(dá)miR-141，Sirt1 mRNA和蛋白水平明顯受到抑制(P<0.01),見(jiàn)圖3C。上述結(jié)果提示Sirt1是miR-141直接作用的靶基因之一。

4 敲減miR-141表達(dá)通過(guò)上調(diào)Sirt1抑制高糖誘導(dǎo)小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步驗(yàn)證高糖環(huán)境、miR-141/Sirt1和小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡三者之間的關(guān)系，我們通過(guò)向SV40-MES-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-141 inhibitor或轉(zhuǎn)染miR-141 inhibitor+siRNA-Sirt1再經(jīng)過(guò)高糖處理，觀察miR-141/Sirt1水平改變對(duì)鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，高糖引起細(xì)胞內(nèi)Sirt1蛋白水平下降和細(xì)胞凋亡水平上升；干擾miR-141表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)高糖引起的Sirt1蛋白水平下降和細(xì)胞凋亡水平上升；干擾miR-141對(duì)Sirt1蛋白水平和細(xì)胞凋亡的作用可以進(jìn)一步被Sirt1水平的下調(diào)所逆轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖4。這一結(jié)果表明，干擾miR-141通過(guò)上調(diào)Sirt1抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡。

Figure 2. Knock-dowm of miR-141 expression inhibited the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose (HG). A: miR-141 expression was detected by qPCR; B: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vs25 mmol/L+miR-NC group.

圖2干擾miR-141抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡

Figure 3. miR-141 directly regulated Sirt1. A: the binding sites between miR-141 and Sirt1 3’UTR; B: miR-141 inhibitor enhanced the luciferase activity of wild-type (WT) Sirt1 3’UTR and increased the mRNA and protein expression of Sirt1; C: miR-141 mimic inhibited the luciferase activity of WT Sirt1 3’UTR and decreased the mRNA and protein expression of Sirt1. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmiR-NC group;##P<0.01vspre-NC group.

圖3Sirt1受到miR-141靶向調(diào)控

Figure 4. Knock-down of miR-141 expression inhibited the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose (HG) through upregulating Sirt1. A: the protein expression of Sirt1 was determined by Western blot; B: miR-141 expression was detected by qPCR; C: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group;&&P<0.01vsHG+miR-141 inhibitor+si-control group.

圖4干擾miR-141通過(guò)上調(diào)Sirt1抑制高糖誘導(dǎo)小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡

5 黃芩苷通過(guò)影響miR-141上調(diào)Sirt1抑制高糖誘導(dǎo)小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡

為了驗(yàn)證黃芩苷對(duì)高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)胞的影響，我們通過(guò)SV40-MES-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-141 mimic或轉(zhuǎn)染miR-141 mimic+pcDNA-Sirt1再經(jīng)過(guò)高糖和黃芩苷處理，觀察黃芩苷對(duì)鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，黃芩苷可以抑制高糖引起的細(xì)胞內(nèi)Sirt1蛋白水平下降和細(xì)胞凋亡水平上升；過(guò)表達(dá)miR-141可以逆轉(zhuǎn)黃芩苷抑制高糖對(duì)Sirt1蛋白水平和細(xì)胞凋亡的作用；過(guò)表達(dá)miR-141對(duì)鼠腎小球系膜細(xì)胞的作用可以進(jìn)一步被Sirt1的過(guò)表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖5。這一結(jié)果表明黃芩苷通過(guò)影響miR-141上調(diào)Sirt1抑制高糖誘導(dǎo)小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡。

討 論

DN是最常見(jiàn)的病理性代謝紊亂(糖尿病)誘發(fā)的末期腎病，其發(fā)病機(jī)理錯(cuò)綜復(fù)雜，尚未完全闡明[6-7]。糖尿病腎病早期形態(tài)學(xué)變化包括腎小球肥大、系膜擴(kuò)張和腎小球基膜損傷，這些造成了腎小球屏障功能失調(diào)也促進(jìn)了DN病理的發(fā)展[8-10]。此外，研究表明由于高糖更易誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡，因此腎小球系膜細(xì)胞損傷造成的腎小球病變?cè)贒N病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[2]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖可明顯誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡。黃芩苷為黃芩中一類黃酮類有效成分，其具有抗過(guò)敏、抗氧化、抗炎及抑制細(xì)胞凋亡等功效[11]，從而發(fā)揮對(duì)生物機(jī)體的保護(hù)作用。據(jù)研究報(bào)道，黃芩苷通過(guò)抗氧化和抗炎作用可有效緩解丙酮醛引起的細(xì)胞毒性和緩解大鼠的糖尿病腎病[12]；此外，黃芩苷可通過(guò)抑制H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激緩解終板軟骨細(xì)胞凋亡[13]，同時(shí)研究表明黃芩苷通過(guò)下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白水平抑制腎臟細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)腎臟作用[3]。本研究發(fā)現(xiàn)加入黃芩苷處理后腎小球系膜細(xì)胞凋亡明顯得到抑制，由此說(shuō)明黃芩苷可緩解高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

Figure 5. Baicalin inhibited the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose (HG) via miR-141/Sirt1 signaling pathway. A: the protein expression of Sirt1; B: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group;&&P<0.01vsHG+baicalin+pre-NC group;△△P<0.01vsHG+baicalin+miR-141 mimic+pcDNA group.

圖5黃芩苷通過(guò)影響miR-141上調(diào)Sirt1抑制高糖誘導(dǎo)小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡

Sirt1是一種依賴NAD+型脫乙酰酶，主要調(diào)控能量約束的下游途徑有利于維持糖穩(wěn)態(tài)，同時(shí)其還參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化和衰老以及調(diào)控糖和脂類的代謝。Sirt1被發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠三叉感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)下調(diào)[14]。研究報(bào)道，缺氧條件下，在成骨細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Sirt1使細(xì)胞內(nèi)的凋亡蛋白表達(dá)下降，從而抑制缺氧引起的細(xì)胞凋亡[15]。白藜蘆醇通過(guò)激活Sirt1活性，使核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)脫去乙?；せ钫麄€(gè)信號(hào)通路，引發(fā)caspase-3介導(dǎo)的凋亡機(jī)制，最終引起軟骨肉瘤細(xì)胞凋亡[16]。因此這些表明Sirt1在細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色。本研究中腎小球系膜細(xì)胞凋亡與Sirt1密切相關(guān)，在高糖誘導(dǎo)下，Sirt1的表達(dá)水平明顯降低，并伴隨著細(xì)胞凋亡水平增加。此外，干擾Sirt1在腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNAs在Sirt1有關(guān)的凋亡途徑中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明多種mi-RNAs通過(guò)直接靶向作用于Sirt1而調(diào)控細(xì)胞的生理過(guò)程。在腫瘤研究中，Sirt1可被上游分子miR-138靶向下調(diào)從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖[17]和抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[18]，以及miR-200a可以通過(guò)靶向結(jié)合Sirt1誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡[19]。在糖尿病狀態(tài)下，miR-34a靶向結(jié)合Sirt1，從而負(fù)向下調(diào)Sirt1/HIF-1α信號(hào)途徑促進(jìn)耳蝸毛細(xì)胞凋亡，引發(fā)糖尿病患者聽(tīng)力障礙[20]。Sirt1的3’-UTR存在miR-211的結(jié)合位點(diǎn)，并受其靶向下調(diào)誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)糖尿病白內(nèi)障的發(fā)展[21]。此外，據(jù)報(bào)道m(xù)iR-141作為調(diào)控子也涉及參與糖尿病的病理過(guò)程[22]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-141在高糖環(huán)境下的小鼠腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，通過(guò)對(duì)其表達(dá)的抑制可有效緩解高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡，并且通過(guò)雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)證明，Sirt1是miR-141介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的下游調(diào)控的靶分子之一。

綜上所述，本研究表明高糖條件(模擬糖尿病環(huán)境)下小鼠腎小球系膜細(xì)胞中miR-141表達(dá)水平上調(diào)，Sirt1表達(dá)受到抑制，造成小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡。黃芩苷可以通過(guò)抑制miR-141過(guò)表達(dá)，促進(jìn)Sirt1表達(dá)水平上升，最終緩解高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療糖尿病腎病的作用。