膝關(guān)節(jié)炎模型體重與病理形態(tài)相關(guān)性及針刀干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究*

張 偉,王 彤,王麗娟,周 帥,孫碩熏,馬詩(shī)凝,郭長(zhǎng)青

( 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是最常發(fā)生的骨骼肌肉系統(tǒng)疾病，亞洲人受累關(guān)節(jié)中膝關(guān)節(jié)所占比重最大，我國(guó)60歲以上人群中膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)發(fā)病率達(dá)50%，發(fā)病患者致殘率高達(dá)53%[1]。隨著人口老齡化加劇，膝骨關(guān)節(jié)炎的防治已成為關(guān)乎民生的公共衛(wèi)生問題。膝關(guān)節(jié)作為主要負(fù)重關(guān)節(jié) ，直立行走時(shí)，其關(guān)節(jié)面的最大軸向作用力為2.3～7.1倍體重[2-3],說明體重是造成關(guān)節(jié)軟骨高負(fù)荷、引起KOA發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一[4]。研究證實(shí)降低體重可以顯著降低KOA的發(fā)生率，減輕KOA的疼痛癥狀[5-7]。針刀療法是在傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)筋理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代解剖及生物力學(xué)的治療方法，臨床對(duì)于KOA及肥胖等均療效顯著[8]。那么針刀對(duì)KOA的治療作用是否也與其減輕體重、降低膝關(guān)節(jié)的應(yīng)力負(fù)荷有關(guān)。體重與軟骨的病理表現(xiàn)程度存在怎樣的關(guān)系，是否體重越重會(huì)加劇膝關(guān)節(jié)的病理表現(xiàn)？目前缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。針刀對(duì)體重造成的膝關(guān)節(jié)高應(yīng)力負(fù)荷會(huì)有怎樣的影響，是否減輕體重也是其發(fā)揮療效的途徑之一?為驗(yàn)證這一假說，本實(shí)驗(yàn)中KOA模型的制備方法為改良后 Videman伸直位固定法,觀察造模、針刀干預(yù)前后的體重及軟骨的光鏡下病理表現(xiàn)，并分析體重與膝軟骨病理改變的相關(guān)關(guān)系；探討針刀減輕體重、降低膝關(guān)節(jié)的應(yīng)力負(fù)荷是否為針刀療效的途徑之一。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡清潔健康級(jí)新西蘭兔40只，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量(2.5±3.0)kg，由北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：DH 201601958)。單籠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(23℃～25℃，濕度60%)，自由攝食飲水，清潔級(jí)飼料及飲用水。依照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置，嚴(yán)格遵循中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理審查要求(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理審查編號(hào)：AN-1001-20173001)。

1.2 試劑及儀器

樹脂樹脂繃帶(5#：150 mm×1 800 mm，衡水康潔醫(yī)療器械有限公司)，可耐特高分子繃帶(KNT03：50 mm×3 600 mm，蘇州可耐特醫(yī)療科技有限公司)，漢章針刀(超微：0.4 mm×30 mm，北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司)，環(huán)球牌針灸針(半寸：0.25 mm×13 mm，蘇州針灸用品有限公司)，英迪牌電子脈沖針療儀(KWD-808-I型，常州英迪電子醫(yī)療器械公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon株式會(huì)社)，精密電子天平JA3000C (上海析域儀器設(shè)備有限公司),FS/FAS5030石蠟切片機(jī)(德國(guó)LETIZ公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，紫外分光光度儀(德國(guó)Eppendorf公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 模型制備

采用改良后Videman法[5]即左后肢伸直位固定制動(dòng)法制備KOA型：空白組不造模，其余各組禁食10～16 h后，麻醉采用3%戊巴比妥鈉溶液耳緣靜脈30 mg/kg注射。麻醉期時(shí)，固定左后肢至完全伸直位。先以樹脂繃帶內(nèi)附脫脂棉從腹股溝到足踝予以固定(膝關(guān)節(jié)伸直180°，踝關(guān)節(jié)跖伸60°)；再以高分子繃帶在樹脂繃帶外纏繞1周以加強(qiáng)固定；待其硬化后外纏防啃咬繃帶以防兔撕咬。留出足趾觀察血供，如有壞死、發(fā)黑等立刻拆除樹脂繃帶，待腫脹消退后再重新開始；及時(shí)重新固定松動(dòng)或脫落的樹脂。累積制動(dòng)6周，造模結(jié)束1周后開始干預(yù)。

1.4 分組及干預(yù)

將40只新西蘭兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、電針組和針刀組4組，每組10只?？瞻捉M不做任何處理；模型組于造模后不做干預(yù)；電針組于造模1周后，在左膝部針刺點(diǎn)“血海-梁丘”“內(nèi)膝眼-外膝眼” 連接電子脈沖針療儀,穴位定位參照 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》，疏密波,頻率2/100 Hz，強(qiáng)度3 mA，20 min/次，3次/周，連續(xù)3周；針刀組于造模1 周后，以龍膽紫定位左膝關(guān)節(jié)股內(nèi)、外側(cè)肌止點(diǎn)和內(nèi)、外膝眼，常規(guī)備皮消毒后于肌腱附著點(diǎn)處進(jìn)針刀，刀口線平行于肌腱及肢體縱軸走向，刀體垂直皮膚刺入后，向肌肉附著點(diǎn)方向施以縱疏橫剝松解，出針刀后加壓片刻，2次/周，連續(xù)3周。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 體重檢測(cè) 分別于造模前1天、造模結(jié)束1天后、干預(yù)結(jié)束1天后的上午8點(diǎn)(進(jìn)食前)，采用電子天平進(jìn)行體重測(cè)量，每次測(cè)量讀數(shù)3次，取其平均值。造模期增長(zhǎng)率=(造模后-造模前)/造模前，干預(yù)期增長(zhǎng)率=(治療后-治療前)/治療前。

1.5.2 病理觀察 分別于干預(yù)結(jié)束1周后，以過量麻醉法處死并進(jìn)行取材。于股骨內(nèi)側(cè)髁切取1 cm×1 cm新鮮軟骨組織，投入10%福爾馬林溶液中固定1周。10% EDTA脫鈣1個(gè)月，石蠟包埋固定及切片(片厚5 μm)，常規(guī) HE 染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察(切片：5張/組，視野：3個(gè)/張)。參照骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織結(jié)構(gòu)病理學(xué)分級(jí) Mankin[9]評(píng)分法對(duì)關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量、軟骨組織染色以及潮線情況進(jìn)行評(píng)分并統(tǒng)計(jì)比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組兔不同時(shí)段體重檢測(cè)

2.1.1 各組兔造模及干預(yù)前后體重 組內(nèi)比較：4組造模后及干預(yù)后體重均比造模前顯著升高(均P<0.01)；4組干預(yù)后體重均比干預(yù)前顯著升高(均P<0.01)。組間比較：造模前，空白組、模型組、電針組及針刀組各兔體重組間比較未見顯著差異(P>0.05)；造模后(干預(yù)前)，與空白組比較模型組、電針組及針刀組的體重均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；干預(yù)后：空白組、模型組、電針組及針刀組各兔體重組間比較未見顯著差異(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組兔造模及干預(yù)前后體重比較

注：與空白組比較,aP<0.05,aaP<0.01；與模型組比較,bP<0.05；與電針組比較,cP<0.05；與造模前比較,dP<0.05,ddP<0.01；與干預(yù)前比較,eP<0.05,eeP<0.01

圖1 各組兔造模及干預(yù)前后體重 注：與空白組比較,aP<0.05,aaP<0.01；與模型組比較,bP<0.05；與電針組比較,cP<0.05；與造模前比較,dP<0.05,ddP<0.01；與干預(yù)前比較,eP<0.05,eeP<0.01

2.1.2 各組兔造模期與干預(yù)期體重增長(zhǎng)率 造模期增長(zhǎng)率：各組造模期體重增長(zhǎng)率組間比較未見顯著差異(P>0.05)。干預(yù)期增長(zhǎng)率：與空白組比較，模型組、電針組及針刀組的體重增長(zhǎng)率顯著降低(均P<0.05),與模型組比較，電針組體重增長(zhǎng)率有減小趨勢(shì)，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),針刀組的體重增長(zhǎng)率顯著降低(P<0.05)。造模期與干預(yù)期比較，空白組、模型組二期間均未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，電針組、針刀組干預(yù)期增長(zhǎng)率均比造模期顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表2、圖2。

表2 各組兔造模期與干預(yù)期體重增長(zhǎng)率比較

注：與空白組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與電針組比較,cP<0.05；與造模期比較,fP<0.05,ffP<0.01

圖2 各組兔造模期與干預(yù)期體重增長(zhǎng)率 注：與空白組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與電針組比較,cP<0.05；與造模期比較,fP<0.05,ffP<0.01

2.2 各組兔膝關(guān)節(jié)病理解剖觀察

空白組關(guān)節(jié)軟骨呈透明藍(lán)白色，無(wú)裂紋及表面缺損，較少量關(guān)節(jié)液，質(zhì)地清澈透明，滑膜色澤淡紅無(wú)水腫。模型組關(guān)節(jié)軟骨呈灰白色不透明，明顯失去原有光澤，表面可見龜裂甚至缺損，明顯滑膜增生及關(guān)節(jié)邊緣纖維性粘連，關(guān)節(jié)液量明顯增多，且呈泡沫狀，渾濁。電針組軟骨顏色較白透亮，未見龜裂及充血，部分滑膜增生黏連，關(guān)節(jié)液量較模型組明顯減少。針刀組軟骨顏色淡白，色澤較亮，部分可見龜裂，滑膜增生明顯減輕，未見明顯充血，關(guān)節(jié)腔內(nèi)見少量清晰關(guān)節(jié)液。見封三彩圖3。

2.3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)觀察

空白組軟骨呈現(xiàn)光滑連續(xù)的表面，基質(zhì)著色均勻，細(xì)胞分層清晰有序、形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，胞漿及軟骨基質(zhì)呈粉紅色；軟骨結(jié)構(gòu)完整、層次清晰，可見移行層、輻射層、鈣化層，厚度正常，軟骨細(xì)胞形態(tài)正常、縱軸與軟骨表面垂直排列，潮線清晰完整，無(wú)軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象，無(wú)血管翳生成,見封三彩圖4A。模型組軟骨完整性被破壞、軟骨基質(zhì)染色減輕且不均勻，軟骨細(xì)胞層次紊亂，表淺層軟骨出現(xiàn)剝脫且軟骨細(xì)胞減少，裂隙進(jìn)入輻射層，局部出現(xiàn)簇集現(xiàn)象，厚度變薄，潮線模糊甚至斷裂，部分見少量血管翳生成,見封三彩圖4B。電針組軟骨結(jié)構(gòu)基本完整，軟骨基質(zhì)染色中度減少，軟骨細(xì)胞彌漫性增生，排列紊亂，但4層較難分辨，厚度基本正常，潮線模糊不清，軟骨層和軟骨下骨層分界不清，未見血管翳生成,見封三彩圖4C。針刀組兔軟骨基質(zhì)染色良好，軟骨結(jié)構(gòu)較清晰，可見移行層、輻射層、鈣化層，表層軟骨基質(zhì)分層可見翻起，表層局部軟骨細(xì)胞排列紊亂，輻射層軟骨細(xì)胞排列規(guī)則，與軟骨表面垂直，潮線較模糊，未見血管翳生成,見封三彩圖4D。

2.4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理Mankin評(píng)分

在治療后，與空白組比較，模型組、針刀組、電針組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分均顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組進(jìn)行比較，針刀組、電針組Mankin評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與電針組對(duì)比，針刀組Mankin評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組兔治療后Makin評(píng)分比較分)

注：與空白組比較,**P<0.01；與模型組比較,##P<0.01；與電針組比較,▲P<0.05

2.5 各組兔體重改變與組織病理評(píng)分的相關(guān)性

散點(diǎn)圖分析可見，膝關(guān)節(jié)軟骨病理Mankin評(píng)分與造模前后、治療前后的體重及造模期與治療期體重變化率分別比較，各點(diǎn)呈不規(guī)則分布，均未發(fā)現(xiàn)顯著的線性相關(guān)關(guān)系；并采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，Mankin評(píng)分與造模前、造模后、治療中、治療后、造模期變化率、治療期變化率的P值均大于0.05。見封三彩圖5。

3 討論

膝關(guān)節(jié)作為主要負(fù)重關(guān)節(jié),直立行走時(shí)，其關(guān)節(jié)面的最大軸向作用力為2.3～7.1倍體重[2-3],前后方向受力為0.35～2.3倍體重[10-11],內(nèi)外側(cè)方向受力較少,為0.13～1倍體重[3,10]。研究發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài),當(dāng)人體在站立或運(yùn)動(dòng)行進(jìn)中,下肢承受著體重并保持平衡，重力傳導(dǎo)通過膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè),使之承受主要的壓應(yīng)力[12]。當(dāng)體重過高會(huì)使膝關(guān)節(jié)的負(fù)荷增大，軟骨磨損嚴(yán)重。故有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)高體重者比低體重者的膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率相差47倍[9]。2015年1項(xiàng)中國(guó)人群膝骨關(guān)節(jié)炎危險(xiǎn)因素的Meta分析研究證實(shí)體重是KOA發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素，控制和減輕體重可以減少KOA的發(fā)生；如果一名女性體重減輕5 kg，將會(huì)使其膝關(guān)節(jié)發(fā)生KOA的概率降低50%[5-6]。同時(shí)減輕體重可顯著減輕KOA患者的臨床癥狀，如Egan BA等研究發(fā)現(xiàn)通過鍛煉減輕體重可明顯緩解膝關(guān)節(jié)的疼痛癥狀[7]。

膝關(guān)節(jié)表面軟骨的存在使得關(guān)節(jié)得以潤(rùn)滑及避免關(guān)節(jié)面間的相互摩擦。光學(xué)顯微鏡下,正常關(guān)節(jié)軟骨的縱切面可分為:表層或切線層、移行層、輻射層、軟骨基質(zhì)鈣化層[13]。在輻射層與軟骨基質(zhì)鈣化層之間有一條波浪形的潮線相隔,可以調(diào)節(jié)軟骨面與體液交換[14]。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)關(guān)節(jié)軟骨的完整性遭到破壞，鏡下呈現(xiàn)層次紊亂、潮線模糊等病理表現(xiàn)[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白組新西蘭兔關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀察呈藍(lán)白色透明，色澤明亮無(wú)裂紋及缺損，關(guān)節(jié)液量較少，質(zhì)地清澈透明，淡紅色滑；鏡下結(jié)構(gòu)完整、層次清晰，無(wú)血管翳生成。經(jīng)過6周的Videman法左后肢固定伸直位造模后，關(guān)節(jié)軟骨明顯失去原有光澤，呈灰白色不透明，可見龜裂甚至缺損，關(guān)節(jié)邊緣纖維性粘連，滑膜增生明顯，關(guān)節(jié)液量明顯增多，且呈泡沫狀，渾濁，但未見明顯的骨贅生成。鏡下軟骨的完整性遭到破壞，潮線模糊甚至斷裂，Mankin評(píng)分顯著升高；說明KOA病早期的模型制備成功。而經(jīng)過電針和針刀治療后，肉眼解剖發(fā)生了明顯的改善；且針刀的鏡下層次較電針組更加清晰，染色良好；二者的Mankin評(píng)分均出現(xiàn)不同程度下降，說明針刀和電針均改善了KOA的早期病理表現(xiàn)，且針刀較電針更加顯著。體重檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在造模前4組新西蘭兔體重未見顯著差異，經(jīng)過6周造模后各組體重均顯著升高，且經(jīng)過造模的要比空白升高幅度更大；經(jīng)過4周干預(yù)后，各組體重進(jìn)一步升高。說明從造模到干預(yù)期，各組體重均呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)。對(duì)于同期不同組間的增長(zhǎng)率進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，模型組、電針組及針刀組在治療時(shí)期的體重增長(zhǎng)率比空白組顯著減小(P<0.05)，且針刀組的體重增長(zhǎng)率顯著減小(P<0.05)。造模期與治療期的增長(zhǎng)率比較發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的兩個(gè)組體重未見差異，而針刀組和電針組于干預(yù)期的體重增長(zhǎng)率均顯著降低，且針刀組的增長(zhǎng)率降低極顯著；說明針刀和電針均可以降低KOA模型的體重增長(zhǎng)率，且針刀效果更加顯著。因此推測(cè)針刀及電針對(duì)KOA的治療作用可能與其降低體重增長(zhǎng)速度有關(guān)；通過降低增長(zhǎng)的體重負(fù)荷來發(fā)揮軟骨保護(hù)的作用，這也與以往理論及研究成果基本一致。

由于骨關(guān)節(jié)炎患者大多體重超重,且患病關(guān)節(jié)疼痛、僵硬,這就限制了患者患病關(guān)節(jié)的活動(dòng),從而引起患者相關(guān)活動(dòng)量減少,這又可能導(dǎo)致患者體重進(jìn)一步增加,從而在體重超重與骨關(guān)節(jié)炎之間形成了惡性循環(huán)[16]。但通過對(duì)體重、體重增長(zhǎng)率與軟骨的病理評(píng)分進(jìn)行散點(diǎn)圖分析可見，膝關(guān)節(jié)HE染色的Mankin評(píng)分與造模前、造模后、治療中、治療后、造模前后變化率、治療前后變化率分別比較，各點(diǎn)均呈不規(guī)則分布，均未發(fā)現(xiàn)顯著的線性相關(guān)關(guān)系；并采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，Mankin評(píng)分與各期體重及其變化率相關(guān)性的P值均大于0.05；這似乎與上面結(jié)果及以往的研究矛盾，不能支持體重與KOA發(fā)病的相關(guān)性。但進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，除正常步態(tài)情況下,若人體于快步行走、上、下樓梯或舉重物時(shí),其膝關(guān)節(jié)的受力明顯增加，髕股關(guān)節(jié)的受力在正常步態(tài)下為0.2～1.8倍體重[17-19],若是在跑步或跳躍時(shí)其可增大至約11倍體重[20]。孟維春等[21]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)異常的高應(yīng)力或反復(fù)劇烈的重力負(fù)荷,作用于關(guān)節(jié)軟骨會(huì)引起軟骨基質(zhì)膠原纖維網(wǎng)的疲勞和斷裂,蛋白多糖隨之丟失,軟骨細(xì)胞暴露。說明活動(dòng)狀態(tài)是決定體重與KOA發(fā)病關(guān)系的關(guān)鍵因素[22]。而本實(shí)驗(yàn)中各組新西蘭兔在適應(yīng)性飼養(yǎng)、造模及治療期均處于獨(dú)立籠中，24 h封閉式飼養(yǎng)；各飼養(yǎng)籠體積不到80 dm見方，嚴(yán)格限制了兔的行走、跳躍等活動(dòng)，這也一定程度限制了體重負(fù)荷對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨的破壞作用，因此本實(shí)驗(yàn)相關(guān)性的結(jié)果也就不難理解；同時(shí)也進(jìn)一步說明，控制劇烈活動(dòng)可以顯著降低體重負(fù)荷對(duì)人體膝關(guān)節(jié)的破壞作用。

綜上，體重是膝骨性關(guān)節(jié)炎的重要風(fēng)險(xiǎn)因素；針刀和電針均可顯著改善KOA兔模型膝關(guān)節(jié)早期炎性病理改變；通過控制體重的增長(zhǎng)速度，達(dá)到保護(hù)KOA關(guān)節(jié)軟骨的作用。同時(shí)適當(dāng)?shù)臏p少奔跑、跳躍或長(zhǎng)距離行走等劇烈活動(dòng)，可以有效降低高體重負(fù)荷對(duì)關(guān)節(jié)的磨損，間接起到保護(hù)膝關(guān)節(jié)的作用。